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人骨髓瘤细胞,NCI-H929-CMV-EGFP细胞基本特性
细胞生长:贴壁生长
细胞形态:上皮样;多角形
细胞数量:1×106个细胞数
细胞传代:1:2传代
人骨髓瘤细胞,NCI-H929-CMV-EGFP细胞的原位染色
(1)贴壁生长的对数期细胞铺在24孔或6孔板中(内有洁净盖玻片),让其爬片生长,待长到50%~80%满时,凋亡诱导剂处理细胞。
(2)将不同时间点处理的细胞进行免疫荧光染色,染色步骤同上。
(3)将染色的爬片细胞放于一张滴有少量甘油(5ml)的载玻片上,荧光显微镜或共聚焦激光扫描显微镜观察TFAR19在细胞中的定位。
临床病理切片的染色、检测。
原代细胞的培养、检测。
分析TFAR19蛋白在人体内各组织器官的分布及定位
透射电子显微镜观察
结果评判:凋亡细胞体积变小,细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期(pro-apoptosis nuclei)的细胞核内染色质高度盘绕,出现许多称为气穴现象(cavitations)的空泡结构;Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;细胞凋亡的晚期,细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体。
DNA片断化检测
细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩, 染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂, 形成50~300kbp长的DNA大片段, 或180~200bp整数倍的寡核苷酸片段, 在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱(DNA ladder)。人骨髓瘤细胞,NCI-H929-CMV-EGFP细胞经处理后,采用常规方法分离提纯DNA,进行琼脂糖凝胶和溴化乙啶染色,在凋亡细胞群中可观察到典型的DNA ladder。如果细胞量很少,还可在分离提纯DNA后,用32P-ATP和脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)使DNA标记,然后进行电泳和放射自显影,观察凋亡细胞中DNA ladder的形成。
大分子染色体DNA片段的测定
细胞凋亡的早期,染色体断裂成为50~300kbp长的DNA大片段。所有超过一定分子量大小的双链DNA分子在琼脂糖凝胶中的迁移速度相同。线性DNA的双螺旋半径超过凝胶半径时,即达到分辨力的极限。此时凝胶不再按分子量的大小来筛分DNA,DNA像通过弯管一样,以其一端指向电场一极而通过凝胶,这种迁移模式称之为"爬行"。因此,细胞凋亡早期产生的50~300kbp长的DNA大片段不能用普通的琼脂糖凝胶电泳来分离。通常采用脉冲电泳技术可圆满地解决这一问题。这个方法是在凝胶上外加正交的交变脉冲电场。每当电场方向改变后,大的DNA分子便滞流在爬行管中,直至新的电场轴向重新定向后,才能继续向前移动。DNA分子量越大,这种重排所需要的时间就越长。当DNA分子变换方向的时间小于电脉冲周期时,DNA就可以按其分子量大小分开。
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