人脐带间质干细胞来源的exosome下调LOXL2缓解小鼠肝纤维化的作用机制研究

目的肝纤维化是肝硬化的必经中间环节,其主要病理过程是肝星状细胞(hepatic slate cell,HSC)活化为肌成纤维细胞、细胞外基质(extracellular matrix,ECM)过量沉积及肝组织结构破坏。前期研究已表明人脐带间质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cell,huc MSC)来源的exosome(huc MSC derived-exosome,huc MSC-Ex)可缓解小鼠肝纤维化,但其具体机制仍不清楚。本研究在此基础上,进一步探讨huc MSC-Ex抗纤维化的作用机制。方法分离培养huc MSC,蔗糖/重水超速离心法提取huc MSC-Ex,透射电镜观察huc MSC-Ex形态,Nano Sight纳米颗粒跟踪分析仪检测huc MSC-Ex直径分布,Western blot检测huc MSC-Ex表面标志物CD9、CD63。体内注射四氯化碳(carbontetrachloride,CCl4)建立BALB/c小鼠肝纤维化模型,并应用huc MSC-Ex进行治疗,分组如下:PBS组(n=10),huc MSC-Ex组(n=10);动物活体成像检测huc MSC-Ex在小鼠体内分布,通过肝脏大体观、H&E染色、Masson染色等技术观察肝纤维化组织结构及胶原沉积,免疫组化和Western blot检测赖氨酰氧化酶样蛋白2(lysyl oxidase-like 2,LOXL2)、HSC活化指标成纤维细胞活化蛋白(Fibroblast Activation Protein,FAP)及α-平滑肌肌动蛋白(α-Smooth Muscle Actin,α-SMA)的表达。体外诱导肝星状细胞(LX-2)细胞活化,与huc MSC-Ex共培养,RT-PCR、Western blot和免疫荧光检测LOXL2、一型胶原(collagenⅠ,COL1)及FAP表达。免疫组化及Western blot检测肝组织及LX-2细胞中Yes相关蛋白(Yes-associated protein,YAP)表达;利用重组腺病毒或质粒过表达或敲除YAP,Western blot检测LOXL2蛋白表达;荧光素酶报告基因检测YAP对LOXL2的转录活性,分析YAP对LOXL2的转录调控作用。Western blot检测huc MSC-Ex中14-3-3ζ表达;利用重组腺病毒转染huc MSC过表达14-3-3ζ,收集提取并鉴定14-3-3ζ过表达exosome(Ad-14-3-3ζ-Ex);Ad-14-3-3ζ-Ex及对照组exosome(Ad-GFP-Ex)与活化的LX-2细胞共培养,Western blot、免疫荧光检测LX-2细胞14-3-3ζ、YAP表达,分析14-3-3ζ与YAP核定位的相关性。结果Huc MSC-Ex呈球形膜性囊状结构,直径30~100nm左右,表达CD9、CD63等exosome表面标志物。动物活体成像显示荧光染料标记的huc MSC-Ex主要集中于肝纤维化小鼠肝脏组织,并且在huc MSC-Ex处理的肝脏中检测到exosome标志物CD63表达。与PBS组相比,huc MSC-Ex组小鼠肝纤维化减轻,肝组织中坏死结构减少,胶原沉积减弱,同时LOXL2表达下调、HSC活化指标FAP及α-SMA表达降低;huc MSC-Ex与诱导活化的LX-2细胞共培养后,LOXL2、COL1及FAP表达下降。在肝纤维化小鼠肝脏及活化的LX-2细胞中YAP核定位及LOXL2表达相关;在293T、LX-2、HL7702细胞中过表达YAP导致LOXL2蛋白表达增加,敲减YAP后,LOXL2蛋白表达下降;荧光素酶报告基因检测表明YAP对LOXL2具有转录调控作用。在活化的LX-2细胞中,Ad-14-3-3ζ-Ex具有比Ad-GFP-Ex更强的LOXL2表达抑制及YAP核定位抑制作用。结论HucMSC-Ex通过下调LOXL2表达抑制HSC的活化,缓解肝纤维化,其机制可能通过转运14-3-3ζ抑制YAP核定位相关。