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产品参数：
| 中文名称 | 英文名称 | 产品规格 | 产品货号 |
| MTT检测试剂盒 | MTT Assay Kit | 500次 | BJ-01X6322 |
MTT广泛用于检测细胞生长，其原理是MTT可以被活细胞线粒体内的脱氢酶还原生成深紫色的formazan结晶，而死细胞则无此活性。深紫色的formazan结晶被溶解后可以通过测定490nm波长的光吸收而测定出其浓度，并由此推测出细胞的活力，细胞增殖越旺盛，则吸光度越高；细胞毒性越大，则吸光度越低。
商品详细介绍：
| 产品特点： 1．采用*的Formazan溶解液，可以充分溶解formazan，减少误差。 2．背景低，灵敏度高，线性范围宽，重复性好。 3．本产品为足够500次(5个96孔细胞培养板)微孔板检测。 4．可用于生物活性因子活性检测、抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验、肿瘤放射敏感性测定等。 储存条件：低温运输、-20℃保存(但溶液B也可以常温运输和保存)，有效期一年。 使用方法： 下面操作是检测细胞毒性的试验，其他应用跟此类似或更简单(如生长曲线试验)，操作步骤可以以此为基础稍作修改即可，故不再赘述。 ㈠、接种细胞 1．按常规消化法消化汇合的单层细胞，收集到含血清的培养基中。 2．200g离心5分钟收集细胞沉淀。 3．用培养基重悬细胞沉淀，制备成单细胞悬浮液并计数。 4．将细胞稀释到2.5×103个/mL～5×10个/mL之间(需要根据细胞的生长速度决定)，如果不知道生长数度，一般可以稀释到1×10个/mL。 5．将足够量的细胞悬液转移到培养皿中(便于用排枪取样)。一个96孔板的MTT检测需要约20mL的细胞悬液。 6．用排枪在96孔板除的第2-11列各孔正中央加入200μL细胞悬液(对正常细胞)。如果是肿瘤细胞，则加入100μL肿瘤细胞悬液和100μL培养基(总体积为200μL)。注意：一定要把细胞加在孔的正中，否则细胞会聚集在孔的角落处，影响试验。 7．用排枪在96孔板除的第1和第12各孔中加入跟细胞悬液等体积的培养基。第1 列各孔将作为+培养基-细胞+MTT对照(用于测OD时调零)，第12列加培养基的作用是减少边缘效应对第11 列反应的影响。 8．按常规细胞培养方法在37℃和5% CO2条件下孵育1-3天，使细胞进入指数生长期。 ㈡、药物处理 9．用培养基将药物稀释到8个待测浓度(如果不知道待测浓度，则需要预试验确定)，一般一种药物需要做3块平行板。 10．去除第2到第11列(共10列)各孔中的培养基(不要触动细胞)，保留第1 列和第12列各孔中的培养基。 11．在第2和第11列(共2列)的各孔中加入200μL新鲜培养基，这些孔将作为+培养基+细胞-药物的对照。 12．在第3到第10列(共8列)各孔中加入8个浓度梯度的待测药物，每列加入一个浓度的药物。 13．按常规方法把96孔板继续放在在37℃和5% CO2条件下孵育一定的时间，此段时间即为药物处理细胞的时间，由用户自己决定。 14．处理结束后去除第2 到第11列(共10列，均含细胞)所有孔中的培养基，并再加入100μL新鲜培养基。 15．每天换培养使细胞数量扩增2-3倍(所需时间随细胞不同而不同)。 ㈢、存活细胞计数 16．在生长末期，去除第1到第11列各孔中的培养基后，再加入100μL新鲜培养基和10μL溶液A(含MTT成分)，用锡箔包裹住96孔板后放在37℃和5% CO2条件下继续培养4-8小时。注意：溶液A在低温情况下会凝固，使用前请室温放置或20-25℃水浴至全部溶解，摇匀后使用。MTT有致癌性，一定要带手套操作。 17．小心吸弃孔内培养基(含溶液A)。由于培养基可能会影响光吸收，最好尽可能去除。 18．每孔加入100μL溶液B，置摇床上低速振荡10分钟，使MTT形成的formazan结晶物充分溶解。 19．由于产物不稳定，故需要立即在酶联免疫检测仪上选择490nm测定吸光度。 注意：用第1 列各孔(+培养基-细胞+MTT对照)调零。 20．计数同样处理的各次重复的平均值。 21．以药物浓度为横轴，以吸光度为纵轴绘制曲线。由于各处理吸光度绝对值差别很大，一般需将其转化成生长抑制率(以不加药物的第2和第11列各孔数据的平均数作为100%)，这样便于计算出IC50，用于各种药物处理效果的比较。注意：如果测生长曲线，则以时间为横轴。正常生长曲线一般呈现S型，具有促进作用的则斜率加大。 |
实验报告：
一、分离与培养：
1、无菌条件下，取出1-3d 龄SD大鼠心房组织，然后用PBS将此组织块清洗2次，最后将组织剪成1mm3左右大小；
2、往组织块中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型胶原酶），混悬10s，置37℃条件下消化10min，之后用滴管吹打制成单细胞悬液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置；
3、剩下的组织再加入3～4mL酶消化液，混悬10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置，重复此步骤2-3次，直至组织*被消化；
4、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液，1200r/min 离心10min，弃去上清，沉淀细胞用含有10％ FBS DMEM/F12培养基混悬，接种于25cm2培养瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培养箱中培养；
5、差速贴壁1h后，吸出培养基，按实验需要接种于6孔板中继续培养；
二、免疫荧光鉴定：
1、待心房肌细胞生长至80%融合时，弃去培养基，用温育的PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min；
2、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在4℃条件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；
3、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在室温条件下，用4% BSA封闭细胞30min；
4、按1: 100的比例稀释α-actin一抗，然后将其放在4℃冰箱中孵育细胞过夜；
5、PBS冲洗细胞3次，每次10min，按1：150的比例稀释抗α-actin的二抗， 37℃条件下放置1h；
6、用PBS冲洗3次，每次10min，最后在倒置荧光显微镜下观察图像并拍照。
培养操作步骤 ：
1．用盖片镊将盖玻片自75%乙醇中取出，用无菌丝绸布擦拭干净，不要用纱布；
2．将盖玻片轻轻放入6孔培养板（每孔一片）或培养皿中（每个平皿可放置2-3片）；
3．在距离紫外灯直射范围内20-30 厘米处照射2-3小时；
4．将经过计数的细胞悬浮液移入培养板中，使盖玻片*浸在培养液中；
5．将培养板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，当贴壁细胞生长至覆盖培养板底部2/3面积时，将培养板取出，用盖片镊轻轻取出盖玻片，用蒸馏水漂洗后即可进行快速固定以及免疫细胞化学检测。 
实验要点及说明：
1．本方法适用于贴壁细胞培养，而不适用于悬浮细胞培养，悬浮细胞可使用滴片法；
2．所使用的盖玻片应该为优质玻璃，并经过铬酸洗液处理；
3．盖玻片非常薄，易碎，取放盖玻片时动作要轻；
4．如果需要更多生长状态一致的细胞，可以使用较大的培养皿，但不宜过大，以避免培养液的浪费和增加污染机率；
5．如果细胞贴壁生长能力较差，可将盖玻片在0.5%多聚赖氨酸溶液中浸泡5-10分钟并自然晾干。
操作要点：
1）将培养基在37℃水浴锅预热；准备一个15mL无菌的离心管，加入8mL预热培养基。
2）将冻存细胞从液氮罐中取出，快速放入37℃水浴锅中复温（可准备一洁净的烧杯，装满37℃的水，细胞冻存管取出后迅速放入烧杯内，再逐步转移到水浴锅中）。轻轻晃动冻存管，使细胞能在1~2min内*解冻，使细胞能尽快通过最易受损的温度段（-5~0℃）。注意冻存管管口不能没入水中，BRL(大鼠肝细胞)避免引起污染。
3）用75%酒精擦拭冻存管后再置于超净台内，将管内细胞转移至准备好的离心管内，轻轻吹打液体，使细胞均匀分散，降低DMSO浓度，吹打时避免产生气泡。用新鲜培养基洗管壁2次，均转移至离心管内。
4）800rpm离心5min，弃上清，加入新鲜的培养基，吹打制成细胞悬液。
5）将细胞悬液转移至T25细胞瓶内，补加适量的培养基，轻轻晃动细胞瓶使细胞分布均匀，放入温箱内培养。
6）第二天观察细胞贴壁生长情况，换新鲜培养基以去除死细胞。继续培养，待细胞长至80~90%汇合时正常传代。一般刚复苏的细胞需经过2~3次传代，细胞活力恢复后才能进行后续的实验。
血管紧张素1转换酶抑制剂抗体
拮抗凋亡转录因子抗体
α-1抗胰
ATP结合蛋白家族6抗体
三磷酸腺苷结合盒亚家族G1抗体
脂联素受体2抗体
ANGEL1蛋白抗体
ANGEL2蛋白抗体
ANKLE2蛋白抗体
睾丸特异性锚样蛋白1抗体
锚蛋白重复结构域蛋白13B抗体
锚蛋白重复结构域蛋白20A1抗体
锚蛋白重复结构域蛋白20A3抗体
锚蛋白重复结构域蛋白22抗体
锚蛋白重复结构域蛋白50抗体
BC-020(人乳腺癌细胞) 5×106cells/瓶×2
BC-021(人乳腺癌细胞) 5×106cells/瓶×2
BC-022(人乳腺癌细胞) 5×106cells/瓶×2
BE(2)-M17(人神经母细胞瘤细胞) 5×106cells/瓶×2
BGC-803(人胃癌细胞) 5×106cells/瓶×2
C918(人眼脉络黑色素瘤细胞) 5×106cells/瓶×2
CAL-27(人舌鳞癌细胞) 5×106cells/瓶×2
LS 180(人结肠腺癌细胞) 5×106cells/瓶×2
CNE-2Z(人鼻咽癌细胞) 5×106cells/瓶×2
MTT检测试剂盒COLO 201(人结直肠腺癌细胞) 5×106cells/瓶×2
CW-2(人结肠癌细胞) 5×106cells/瓶×2
CRT(人神经胶质瘤细胞) 5×106cells/瓶×2
D283 Med(人脑髓母细胞瘤细胞) 5×106cells/瓶×2
EA.hy926(人脐静脉细胞融合细胞) 5×106cells/瓶×2
ECV-304(人脐静脉内皮细胞) 5×106cells/瓶×2
EJ(人膀胱癌细胞) 5×106cells/瓶×2
H-97(人高转移肝癌细胞) 5×106cells/瓶×2
