细胞：HBdSMC细胞

中文名称：人膀胱平滑肌细胞

生长特性：贴壁

培养基：SMCM

冻存条件：50%基础培养基、40% FBS、10% DMSO

HBdSMC细胞传代：

1）：细胞密度约80%时，吸出原培养瓶中的培养基，PBS缓冲液润洗细胞两次，加2~3 ml 0.25% yi酶进行消化细胞（注意根据实际情况，把握消化时间）。

2）：镜下观察消化情况，在细胞边缘缩小，贴壁松动时（可用吸管吸起些许yi酶轻轻吹打细胞层某处，即可肉眼可见细胞层脱落，或吹打后镜下观察吹打处，即消化完成，否则继续消化）直接吸掉yi酶，加3~4ml 培养基，轻轻吹打细胞层，把细胞层吹落，吹散。

3）：取部分细胞悬液转移到新的培养皿中，添加适当的培养基，把细胞悬液打匀，于培养箱中培养。

4）：注意培养基PH值变化情况，定期换液（每周2-3次），待细胞密度达到80%以后重复1项操作或者冻存。

（网络信息主针对网络推广作用，仅供参考，细胞培养请咨询细胞库管理员，以细胞库管理员提供给您的信息为准，操作前，如果有不明白之处，先咨询细胞库管理员，避免不必要的损失；）

基因分型(AIV)核酸检测

逆转录  根据标本数取0.2ml DEPC 处理的PCR反应管，取出AIV -RT MIX室温溶解，向反应管中每管加入7μl AIV-RT MIX，1μl逆转录酶系(使用前请10,000rpm瞬时离心30s)， 以及2μl 上述获得的RNA，10,000rpm瞬时离心30秒，将各反应管放入PCR仪器的反应槽内，在PCR仪上进行以下循环：42℃ 30分钟后98℃5分钟灭活逆转录酶。

3．PCR扩增

12345678

AIV-UAIV-H5AIV-H7AIV-H9AIV-UAIV-H5AIV-H7AIV-H9

备注：每排管盖标记处为1，每排共8管可检测2个样品，每盒5排共可检测10个样品。

取出AIV-反应管，加入处理后样品(或阴性质控品、AIV阳性质控品)3μl，10,000rpm瞬时离心30s。做好标记，置PCR反应槽内，设置反应体积(30μl)、按照下列条件扩增，94℃ 2min，93℃ 30s→58℃ 30s→72℃ 30s ，共35个循环。

4．电泳检测

4.1 2%琼脂糖凝胶配制：稀释50×TAE（或5×TBE）至1×TAE(取20ml50×TAE，加980 ml双蒸水至1L)，称4g琼脂糖放于500mL 锥形瓶中，1×TAE 200 ml,置入微波炉中加热熔解(避免加热沸腾溶液外溢)，再加入20μl 溴化乙锭(EB)充分混匀。在电泳槽内放好梳子，倒入琼脂糖凝胶，待凝固后使用。

4.2 电泳检测：直接取PCR 扩增产物15μl，用加样枪点样于琼脂糖凝胶孔中，以5V/cm 电压，1×TAE中电泳，紫外灯下观察结果。