动物支气管炎病毒(AIBV)核酸检测实验

实验目的：

检测动物体液、肾脏、淋巴结、咽、泄殖腔试子、肺脏等组织标本以及细胞培养液中传染性支气管炎病毒(AIBV)RNA，适用于传染性支气管炎病毒(AIBV)感染的辅助诊断及流行病学调查，其检测结果仅供参考。

实验原理：

选取一对支气管炎病毒(AIBV)特异性引物和一条特异性荧光探针，应用Trizol提取RNA，经逆转录酶作用将RNA转录成cDNA，后者在Taq酶作用下，配以FQ-Buffer(内含Mg2+、Tris-HCl等)、四种核苷酸单体（dNTPs）等成分，用一步PCR荧光探针法对禽传染性支气管炎病毒(AIBV) RNA进行扩增，从而达到快速检测之目的。

标本采集： 

1）：咽及泄殖腔等试子标本采集：用棉试子取咽或泄殖腔分泌物，将试子放入盛有1.0ml PBS(或生理盐水)的离心管中，立即送检。

2）：组织标本采集：取动物肺、肝、脾、肺、肾、淋巴结及胰腺等组织约1g，置入1.5ml洁净EP管，立即送检。

3）：体液及培养液体标本采集：取上述标本约1ml，置入1.5ml洁净EP管，立即送检。

实验方法：

1）：样品处理：

培养物、试子等液体标本：将标本充分混匀，取100μ液体标本加入500μl RNA提取液A（Trizol reagents）充分震荡，室温放置5min。

固体组织：取50mg左右组织用玻璃匀浆器匀浆或剪刀剪碎，加入500μl RNA提取液A（Trizol reagents），研磨或振荡至匀浆状，转移到1.5ml的EP管中，室温放置5min。

2）：加入100μl氯仿，用力震荡15s，室温静置5min，4℃ 13,000rpm离心5min。

3）：小心将上层水相转移到干净离心管中，加300 μl 无水乙醇，另加10μl RNA提取液B（内含不溶物，使用前室温溶解并充分混匀），充分混匀，13,000rpm离心1min。

4）：.弃上清，加入500μl 75%的DEPC乙醇，充分混匀，13,000rpm离心1min，小心吸去大部分乙醇。

5）：.将提取管敞口在室温空气中干燥5min待乙醇挥发干净，用20µl DEPC H2O溶解沉淀。

阴性质控品：取100μl阴性质控品加入500μl RNA提取液A（Trizol reagents）充分震荡，室温放置5min。后按1.2~1.5操作。