实验原理
在以微生物为材料的遗传学研究中，用某些物理因素或化学因素处理细菌，使基因发生突变，丧失合成某一物质（如氨基酸、维生素、核苷酸等）的能力，因而它们不能在基本培养基上生长，必须补充某些物质才能生长。这样从野生型经诱变筛选得到的菌株，称为营养缺陷型。

筛选营养缺陷型菌株必须经过以下几个步骤：诱变处理、淘汰野生型、检出缺陷型、鉴定缺陷型。由于本实验是以大肠杆菌为材料，所以根据细菌的特性分别说明筛选的步骤。
诱变剂的作用主要是提高突变频率，它分为物理和化学的二类。

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物理诱变剂常用的有X射线、紫外线、快中子、γ射线等诱变处理首先是选择诱变剂，微生物诱变中zui常用的物理诱变剂是紫外线。
诱变剂所处理的微生物，一般要求呈单核的单细胞或单孢子的悬浮液，分布均匀，这样可以避免出现不纯的菌落。用于诱变处理的微生物一般处于对数生长期，那时的细菌对诱变剂的反应zui灵敏。
诱变处理必须选择合适的剂量，剂量的表示有二种，剂量和相对剂量。

剂量的单位以尔格/cm2表示，一般用相对剂量。相对剂量与三个因素有关，这三个因素是：诱变源和处理微生物的距离，诱变源（紫外灯）的功率，以及处理的时间。

前二个因素是固定的，所以通过处理时间控制诱变剂量。各种微生物的处理zui适剂量是不同的，须经预备实验确定。

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经处理以后的细菌，缺陷型还是相当少的，必须设法淘汰野生型细胞，提高营养缺陷型细胞所占比例，以达到浓缩缺陷型的目的。细菌中常用的浓缩法是青霉素法。

二、实验材料
大肠杆菌K12的野生型菌株大肠杆菌（Escherichiacoli）K12SF+。

三、实验器具和药品
1.用具：灭菌培养皿（9厘米），灭菌三角烧瓶（150毫升），灭菌吸管（1.5毫升），灭菌离心管。
2.培养基：
（1）肉汤液体培养基：牛肉膏0.5克，蛋白胨1克，NaCl0.5克，蒸馏水100毫升，pH7.2，高压灭菌15磅/英寸215分钟。
（2）肉汤液体培养基（ZE）：牛肉膏0.5克，蛋白胨1克，NaCl0.5克，蒸馏水50毫升，pH7.2，高压灭菌15磅/英寸215分钟。
（3）基本液体培养基：Vogel50×2毫升，葡萄糖2克，蒸馏水98毫升，pH7.0，高压灭菌8磅/英寸230分钟。

青霉素是杀菌剂，它只杀死生长的细胞，对不生长的细胞没有致死作用。所以在含有青霉素的基本培养基中野生型能长而被杀死，缺陷型不能长被保存得以浓缩。
检出缺陷型的方法有逐个测定法、夹层培养法、*补给法、影印培养法。这里主要以逐个测定法为例进行说明。把经过浓缩的缺陷型菌液接种在*培养基上，待长出菌落后将每一菌落分别接种在基本培养基和*培养基上。凡是在基本培养基上不能生长而在*培养基上能长的菌落就是营养缺陷型。
经初步确定为营养缺陷型的菌用生长谱法鉴定。在同一培养皿上测定一个缺陷型对多种化合物的需要情况。

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1．酶标抗体的制备
2．取材 将培养细胞或悬浮细胞用0.1Mol/L PBS液冲洗，离心沉淀后，立即转入固定液(2%甲醛液或2%戊二醛液均可)pH 7.2，4℃固定5min～30min(依抗原性质所定)。如病料为组织块，则取适当大小，先固定1h然后取出，以新的双面刀片切成50～100μm的薄组织再行固定1h～2h。
3．漂洗 以PBS液漂洗夜，换液3～4次。
4．血清孵育，25℃1h或4℃夜，孵育的标本放置于加盖的瓷盘内，底层垫数层纱布。防止抗血清干燥凝固，不易洗脱，造成非特异性吸附。
5．PBS冲洗3～4次，每次10min。
6．2.5%戊二醛再固定15min～30min。
7．PBS液冲洗3～4次每次10min。
8．酶标记抗体孵育；用适当稀释的酶标抗体(即工作浓度)于25℃湿盆内孵育1h或4℃夜。
9．PBS液冲洗3～4次每次10min或4℃漂洗夜。
10．酶显色处理 将漂洗后的标本浸入DAB－H2O2底物溶液中，20℃，10min～30min。显色强弱与戊二醛的固定有关。若显色弱则可减少甚至取消戊二醛的固定时间。冲洗时必须注意防止非特异漂浮的沉积。
11．常规包埋、切片、电镜观察 在经过脱水包埋确定抗原性不致引起失活的前提下可在包埋切片后做标记染色，切片一般在2μm～4μm，切片后染色不存在通透困难的问题。无论在标记染色后切片还是在切片后标记染色，在光镜下定位选择后，再做电镜定位包埋，这样目的性强，可减少工作量。