一、原理与意义

    通过抗原和抗体在体外特异结合后出现的各种现象,对样品中的抗原或抗体进行定性和定量检测。本实验采用双抗体夹心ABC-ELISA法,用抗小鼠TNF-a单抗包被于酶标板上,标准品和样品中的TNF-a与单抗结合,加入*化的抗小鼠TNF-a抗体,形成免疫复合物连接在板上,辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(Streptavidin)与*结合,加入酶底物邻苯二胺(OPD),出现黄色,加终止液浓硫酸,颜色变深,在492nm处测OD值,TNF-a浓度与OD值成正比,可通过绘制标准曲线求出标本中TNF-a浓度。它是样品中蛋白质含量检测的定性和定量方法。

二、试剂盒的组成

    96/48微孔板(1块,已包被抗小鼠TNF-a单抗)、样品稀释液(1瓶)、*抗体工作液(1瓶)、酶标抗体工作液(1瓶)、底物稀释液(1瓶)、终止液(1瓶)、洗涤液(20×,1瓶)、标准品(2000 pg/ml,2管,冻干粉)、OPD片(3片)、坐标纸(1张)。

四、操作步骤

1、设立标准孔8孔(根据样品蛋白浓度可调整为6孔),每孔中先各加入样品稀释液100 ul,*孔再加标准品100 ul,混匀后用移液器吸出100 ul,移至第二孔,如此反复作对倍稀释至第7孔,zui后,从第7孔中吸出100 ul弃去,使之体积均为100 ul。第8孔为空白对照。

2、加样:待测样品孔中每孔各加入待测样品100ul。

3、将反应板置于37 ℃×120 min。

4、洗板:用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次,向滤纸上扣干。

5、每孔中加入*抗体工作液50ul。

6、将反应板充分混匀后置37 ℃×60 min。

7、洗板:用洗涤液将反应板充分洗涤4~6次,向滤纸上扣干。

8、每孔加酶标抗体工作液100ul。

9、将反应板置于37 ℃ 120 min。

10、洗板:用洗涤液将反应板充分洗涤4~6次,向滤纸上扣干。

11、每孔中加入底物工作液100ul, 置于37 ℃暗处反应5~10 min。

12、每孔中加入50ul终止液混匀。

13、用酶标仪在492 nm处测吸光值。