人前列腺酸性磷酸酶(PAP)ELISA试剂盒检测原理
试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)。往预先包被抗体的包被微孔中,依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体,经过温育并洗涤。用底物TMB显色,TMB在化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的5羟色胺(5-HT)呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度(OD 值),计算样品浓度。

样品收集、处理及保存方法
1.  血清:使用不含热原和内毒素的试管,操作过程中避免任何细胞刺激,收集血液后,3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。
2.  血浆:EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000转离心30分钟取上清。
3.  细胞上清液:3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。
4.  组织匀浆:将组织加入适量生理盐水捣碎。3000转离心10分钟取上清。
5.  保存:如果样本收集后不及时检测,请按一次用量分装,冻存于-20℃,避免反复冻融,在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

自备物品
1. 酶标仪(450nm)
2. 高精度加样器及枪头:0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL
3. 37℃恒温箱

操作注意事项
1.  试剂盒保存在2-8℃,使用前室温平衡20分钟。从冰箱取出的浓缩洗涤液会有结晶,这属于正常现象,水浴加热使结晶wan全溶解后再使用。
2.  实验中不用的板条应立即放回自封袋中,密封(低温干燥)保存。
3.  浓度为0的S0号标准品即可视为阴性对照或者空白;按照说明书操作时样本已经稀释5倍,最终结果乘以5才是样本实际浓度。
4.  严格按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。
5.  所有液体组分使用前充分摇匀。

试剂盒组成
名称     96孔配置     48孔配置     备注
微孔酶标板     12孔×8条     12孔×4条     无
标准品     0.3mL*6管     0.3mL*6管     无
样本稀释液     6mL     3mL     无
检测抗体-HRP     10mL     5mL     无
20×洗涤缓冲液     25mL     15mL     按说明书进行稀释
底物A     6mL     3mL     无
底物B     6mL     3mL     无
终止液     6mL     3mL     无
封板膜     2张     2张     无
说明书     1份     1份     无
自封袋     1个     1个     无
注:标准品(S0-S5)浓度依次为:0、15、30、60、120、240 ng/mL

试剂的准备
20×洗涤缓冲液的稀释:蒸馏水按1:20稀释,即1份的20×洗涤缓冲液加19份的蒸馏水。

洗板方法
1.  手工洗板:甩尽孔内液体,每孔加满洗涤液,静置1min后甩尽孔内液体,在吸水纸上拍干,如此洗板5次。
2.  自动洗板机:每孔注入洗液350μL,浸泡1min,洗板5次。

操作步骤
1.  从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条,剩余板条用自封袋密封放回4℃。
2.  设置标准品孔和样本孔,标准品孔各加不同浓度的标准品50μL;
3.  样本孔先加待测样本10μL,再加样本稀释液40μL;空白孔不加。
4.  除空白孔外,标准品孔和样本孔中每孔加入辣根化物酶(HRP)标记的检测抗体100μL,用封板膜封住反应孔,37℃水浴锅或恒温箱温育60min。
5.  弃去液体,吸水纸上拍干,每孔加满洗涤液,静置1min,甩去洗涤液,吸水纸上拍干,如此重复洗板5次(也可用洗板机洗板)。
6.  每孔加入底物A、B各50μL,37℃避光孵育15min。
7.  每孔加入终止液50μL,15min内,在450nm波长处测定各孔的OD值。

结果判断
绘制标准曲线:在Excel工作表中,以标准品浓度作横坐标,对应OD值作纵坐标,绘制出标准品线性回归曲线,按曲线方程计算各样本浓度值。
   
试剂盒性能
1.  准确性:标准品线性回归与预期浓度相关系数R值,大于等于0.9900。
2.  灵敏度:检测浓度小于1.0 ng/mL。
3.  特:不与其它可溶性结构类似物交叉反应。
4.  重复性:板内、板间变异系数均小于15%。
5.  贮藏:2-8℃,避光防潮保存。
6.  有效期:6个月

免责声明
1.   试剂盒仅供研究使用,不得用于临床实验或人体实验,否则所产生的一切后果,由实验者承担,本公司概不负责。
2.   严格按照说明书操作,实验者违反说明书操作,后果由实验者承担。