细胞冻存及复苏的基本原则和原理

细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。如今细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。

细胞冻存的基本步骤

（一）细胞冻存

1.配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液；

2.取对数生长期的细胞，去除旧培养液，用PBS清洗。

3.去除PBS，加入适量胰i蛋白酶（覆盖培养皿表面）把单层生长的细胞消化下来；

4.离心1000rpm，5min；

5.去除胰i蛋白酶，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml；

6.将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5 ml；

7.在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；

8.冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。

（二）细胞复苏

1.从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。

2.从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；

3.离心，1000rpm，5min；

4.弃去上清液，加入含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养；

5.次日更换一次培养液，继续培养。