1、动物的选择

羊、马、鸡、猴、豚鼠，都是常用的免疫动物，在实验中，选择动物时应考虑抗原与动物的种属关系、抗原性质与动物种类、免疫血清的需要量、免疫血清的要求以及动物个体等因素。免疫用动物应选适龄、健壮．最好为雄性。最chang用的实验动物是家兔，一般选择选择年龄在6个月以上当年繁殖的♂性，体重2 ～3公斤，健康家兔三只，免疫前用金属编号牌固定兔耳，或用染料涂沫在动物的背部，作出明确的标记。

2、抗原制备

1）抗原稀释：用灭菌生理盐水将抗原稀释为2mg/ml，于免疫前一天加入溶液，使每毫升抗原溶液含青mei素1000 UI，链mei素1000 UI，放4℃过夜（一般可不加青、链mei素）次日取出，与佐剂混合制成乳剂后用于动物免疫。

免疫原的注射剂量应考虑其抗原性的强弱、分子量大小、动物的个体状态和免疫时间。对于纯的可溶性抗原的免疫剂量，通常小鼠首ci次抗原剂量为50～100μg/次，大鼠为100～200μg/次，兔为100μg ～1 mg/次，合成免疫原为2 mg(半抗原约为20～200μg)，一般需要与等量的福氏完wan全佐剂混合。加强免疫的剂量为首ci次计量的1/2，通常用不完wan全福氏佐剂或不用佐剂。如需制备高度特异性的抗血清，可选用低剂量抗原短程免疫法；反之，欲获得高效价的抗血清，宜采用大剂量抗原长程免疫法。

2）佐剂和抗原乳剂的配制

1佐剂的配制：福氏完wan全佐剂（Freund’s complete adjuvant），各实验室的配方不尽相同，我室采用的配方如下：

医用液体石腊 20毫升

羊毛脂 12克

水浴溶化、混匀，分装于青mei素小瓶，用纱布、线绳扎紧瓶塞。8磅20分钟灭菌，4℃保存备用。于免疫前准备抗原乳剂制备时，以活卡介苗（有时亦用死卡介苗）代替死结核菌，每毫升试剂中加入10mg活卡，即为福氏完wan全佐剂。

2抗原乳剂的制备：其方法一般有两种，其一，将等量的完wan全佐剂（注意佐剂必须预先加热融化，但不超过50℃）和抗原溶液分别吸入两个5ml注射器内，在两个注射器的12# 针头间套上一根长约8～12cm的医用无毒塑料管，将两个注射器连接在一起（塑料管必须先经酒精浸泡消毒，使用时取出，用灭菌生理盐水冲洗后，与注射器针头相连接，塑料管与针头的口径须合适，不能松，稍紧些为宜），针头插进塑料管约1～2cm然后由两人相对而坐后缓缓推动针蕊，使管内溶液进入塑料管道至对侧注射器内，每次推动针蕊时必须把管内容物全部推出，另一侧也同样操作，使管内液体往返混合，直至形成油包水乳剂（Water-in-oil enulsion）为止。

其二是，将等量的佐剂和抗原溶液倒入钵内，经过反复碾磨，也可形成油包水乳剂，该法主要优点是快速，可靠，不足方面主要是由于粘附过多，浪费佐剂及抗原。

制成的乳剂是否形成油包水乳剂直接影响免疫效果，因此，必须进行质量检查，检查的方法是将制成的乳剂滴一滴在凉水（自来水）表面，质量合格的乳剂滴入水面保持滴珠完整而不分散，不合格者进入水面后立即扩散，水面油亦逐渐扩大，这就必须要继续操作至质量合格为止。

但有时，由于佐剂的配制质量原因，很难乳化至合格，遇有这种情况，须考虑重新配制佐剂。

3、免疫途径，剂量和免疫周期

抗原注射途径可根据不同抗原及试验要求，选用皮内、皮下、肌肉、静脉或淋巴结内等不同途径注入抗原进行免疫。一般常采用背部、足掌·耳后等处皮内或皮下多点注射。初次免疫与第二次免疫的间隔时间多为2～4周。常规免疫方案为抗原加CFA皮下多点注射进行基础免疫；再以免疫原加IFA作2～5次加强免疫，每次间隔2～3周，皮下或腹腔注射加强免疫。

1）常规（皮内多点注射）免疫：

1第一次免疫：剂量为每只兔子注射1.0 ml抗原乳剂（含抗原量1～2mg）。注射部位为两只后脚掌的皮内各注射0.2 ml，其余0.6 ml分多点注入脊柱二侧，颈部，腹股沟和腋窝等处淋巴结附近部位皮内，每点可注入0.05ml，分12点注入。

2第二次免疫：初次免疫后20天左右，剂量为1.0ml/只（1～2 mg/ml），加福氏不完wan全佐剂。注射部位在腹部皮下多点注射，每点注入0.1 ml。

3第三次免疫：再次免疫后两周内进行，注射剂量和部位同第二次免疫，免疫后7～14d抽取少许静脉血，分离血清，试血测定效价。

2）淋巴结免疫：主要优点是可减少用量。过程如下：

1卡价苗致敏：免疫前足掌皮下每侧各注入活卡价苗（75 mg/ml）0.3 ml。10天左右观察两侧腘窝淋巴结，一般可肿胀如蚕豆大小，此时即可进行淋巴结内免疫注射。

2第一次免疫：用手指zhi定淋巴结后在两侧腘窝淋巴结内各注入抗原乳剂0.25ml，每只兔总量0.5 ml；为加强免疫，于初次免疫20天后，于腹部皮下多点注射不加佐剂抗原溶液1mg/1ml。

3二周后可如同第一次免疫的剂量和途径再注射一次，一般可在第三次免疫注射前试血滴定效价，效价如已达到要求可不必进行第三次免疫。

有条件的情况下，免疫后要加强动物饲料管理，如给熟黄豆饲养等。

3）腹腔免疫：一般不必加佐剂，适用于细胞性或颗粒性抗原，而且抗原性较强者，例如用绵羊红细胞免疫家兔或小鼠即可用此法。

4、试血，测定抗体效价

一般在第三次免疫后7～10天即可于兔耳静脉或小鼠尾尖取少量血，分离出血清之后进行试血。

① 环状试验，较为经典的方法，较少采用，如与20μg/ml以下的抗原于30 min内能出现“++”的沉淀环，即测定抗体效价达1：5000以上时为合格。

② 免疫双扩散法，这是最chang用的试血方法，其具体方法是，中间孔加稀释的抗原（1mg/ml）10μl，周围孔顺时针方向加制备的抗血清分别为1:2, 1:4, 1:8，1:16，1:32和1:64，（用生理盐水或PBS稀释）。经37℃保温24h后观察结果，效价在1:16以上即可决定放血。

5、放血

经效价检查合格后即可放血。放血前动物应停食12 h，以减少血清中的脂肪含量。如拟保留该免疫动物，可直接由心脏取血，或切开耳缘静脉滴血或心脏穿刺取血。取血后由静脉缓缓注入等量5%葡萄溶液以补足失血量。取血的动物经2～3个月休息，可再次加强免疫后取血。如拟一次放血致死，可用颈动脉放血的方法，各种取血方法如下。

1）心脏取血：固定动物于仰卧位置，用食指探明心脏博动量高部位（在胸骨左侧，由下向上数第3与第4助骨之间，指兔），剪去少许毛，用2.5% 碘酒和75%酒精消毒后，以9#针头在预定位置与胸部呈45。角刺入心脏，微微上下移动针头，待见血液进入针筒后，即将注射器位置固定取血。2.5公斤体重的家兔一次可取血20～30ml。

2）耳缘静脉滴血：先将耳缘静脉附近的毛剪去用无菌棉球将皮肤擦干净（不用酒精消毒，避免溶血）。用台灯照射耳部使血管因温度增高而扩张，然后用无菌刀片将耳缘静脉切一长0.5cm的纵切口，第一次切口应从耳尖部开始，以后再切时，逐步向耳根方向移动。用无菌试管或平皿收集流出的血液。如切口凝血，血流不畅时，可用无菌棉棒轻轻将切口外血凝块擦去（注意勿使切口损伤太大），血流仍可继续流出，直至达到所需要的血量为止。取血后用无菌棉球压迫切口止血。耳缘静脉取血一次可取血50ml左右而动物不死。

3）颈动脉放血：使动物仰卧固定四肢，颈部剪毛、消毒后纵向切开前颈部皮肤长约10cm，用止血钳将皮肤分开夹住，剥离皮下组织，露出肌层，用刀柄加以分离，即见搏动的颈动脉。小心将颈动脉和迷走神经剥离长约5cm，选择血管中段，用止血钳夹住血管壁周围的筋膜。远心端用丝线结扎，近心端用动脉钳夹住，用酒精棉花球消毒血管周围，用无菌剪刀剪一V形缺口。取长2.5cm、直径为1.6mm塑料管一段，将一端剪成针头样斜面，并将此端插入颈动脉中，另一端放入200ml无菌三角瓶内，然后放开止血钳，血即流入三角瓶内，动物流血至死，2.5公斤家兔可放血80～100ml。

6、分离血清

必须在无菌条件下进行，待收集于平皿或三角瓶内的血液凝固之后，用无菌滴管在无菌环境（例如超净工作台）中把血kuai块与瓶壁剥离后，放入37℃，1～2h取出后放入4℃过夜，使血清充分析出（不能冰冻，否则产生溶血），经离心沉淀分出血清，放进低温冰箱保存。使用前必须经过签定合格后再分装保存备用。

7、抗血清的保存

1）经签定合格后的抗血清，以1:100比例加入1%的硫柳汞或5%的叠氮钠，使其最后浓度分别为0.01%或0.05%。

2）用无菌滴管将抗血清分装小管，每管装1ml左右。

3）-20℃以下保存，可保存2年以上。

4）如有条件可将血清冷冻干燥保存于4℃以下，保存时间更久。