甘油保存菌种的基本要求

1.20%甘油保存菌种是指甘油:菌液=20:80,800ul菌液加200u灭菌l甘油后的甘油后,充分混匀后,-70度保藏.(注意甘油要慢慢吸)

2.将一般细菌的菌种纯化后接种于普通肉汤管，4～6h增菌后，加入适量甘油一生理盐水保存液，-20℃冰箱保存；链球菌属和奈瑟氏菌属的菌株纯化后接种于血清肉汤管，在5％～10％CO2中经8～10h增菌后，加入适量保存液，80℃低温冰箱保存；真菌菌种纯化后直接取菌洗入肉汤，不做培养，加入保存液后，-20℃冰箱保存。结果在连续3年实验期内，各菌种保存效果良好，且其形态结构、染色特性、生化反应等与标准株相符。结论使用甘油生理盐水保存法来保存菌种，各菌种保存时间长，方法简便，特别是使链球菌、奈瑟氏菌和弧菌等需特殊保存方法保存的菌株在一般实验室得以保存。

3.常用的是终浓度10-30%的甘油。由于纯甘油十分粘稠，很难定量，一般配成终浓度50%的水溶液，高压灭菌后室温保存即可。使用时按50%甘油:菌液=1:1混合均匀，然后迅速冻结。

A.先把甘油稀释成50%，然后灭菌这样20%的终浓度用400微的菌体加600微的50%甘油混合不就可以啦纯的甘油太粘稠啦，用枪不好吸的

B终浓度15%。甘油配成80%的浓度，到时候加800微升菌体，200微升甘油就好。简单的就在原来的培养基，如LB，或生理盐水中加甘油，终浓度在20%左右，悬浮沉淀后装小管扔冰箱冻起来就可以了。但时间不能太长，不要超过2~3个月，时间长了要重新活化、筛选。

甘油和水是互溶的，根本不是什么密封作用！甘油是为了防止冷冻结晶破坏细胞

甘油管保藏的菌种可以通过以下步骤复壮：

1. 将无菌操作台灭菌30min后，用75％酒精棉球消毒包括手在内的所有物品。

2. 使用灭菌接种环扣取甘油管中的冷冻菌块，放入3mlLB液体培养基中。

3. 在37℃、150rpm的条件下过夜培养。

4. 将过夜菌液重新按照步骤2和步骤3活化一次，经过2次活化的菌液即可用于实验。

请注意，操作过程应适当快一些以减少冻存管内的融化，并且应提前准备好所有物品，再从冰箱中取出保藏菌种。