人血清实验目的:利用基因工程技术,克隆、表达和纯化具有生物活性的人脂联素球状结构域(gAPN)重组蛋白,建立一种简便、快捷的检测人血清脂联素(APN)浓度的酶联免疫吸附法(ELISA),进一步探讨其与冠心病(CHD)的关系。
方法:1.利用基因克隆技术,构建表达质粒pET22b-gAPN,在原核表达系统大肠杆菌中重组表达、纯化人gAPN重组蛋白,并通过观察链脲佐菌素(STZ)诱导的高血糖小鼠模型血糖改变验证其生物学活性。
2.用抗APN单克隆抗体包被微孔板,10%小牛血清为封闭液,另一针对APN不同抗原表位的单克隆抗体*化后作为检测抗体,联合*-链霉亲和素信号放大系统,以重组的gAPN蛋白为标准品绘制标准曲线,建立检测人血清APN浓度的定量ELISA方法。
3.利用建立的ELISA方法,检测161例临床血清样本APN水平,经冠状动脉造影结果确诊CHD患者共103例,非CHD患者58例,进一步分析血清APN与CHD发病、冠状动脉病变狭窄严重程度及CHD危险因子之间的关系。
结果:1.成功构建了pET22b-gAPN质粒,获得了人gAPN重组蛋白(分子量约15kD),可溶性尚可,产量较高(1.57mg),纯度＞90%。Western印迹鉴定其具有抗原活性,且该蛋白具有降低高血糖小鼠模型血糖的生物学活性。
2.成功建立了检测人血清APN含量的ELISA方法。该检测方法的灵敏度为150pg/ml,血清检测准确性、特异性、线性、重复性好,回收率为91.0%-108.0%。与国内深圳依诺金科技有限公司的人APN浓度ELISA定量检测试剂盒的相关性良好(r=0.935,P＜0.001)。
3.临床检测表明,CHD组APN浓度明显低于非CHD组[5.67(2.59-10.47)mg/L VS 7.14(4.37-11.40)mg/L,P＜0.01];非CHD组中,女性血清APN浓度高于男性[8.92(5.84-15.53)mg/L VS4.68(3.11-9.05)mg/L,P＜0.01],而在CHD组中,女性血清APN却低于男性[4.20(1.83-6.05)mg/L VS 5.96(2.71-10.90)mg/L],但差别没有统计学意义(P＞0.05)。随着Gensini积分升高,冠状动脉狭窄程度加重,APN含量降低,但各组间无统计学差异。血清APN浓度与hs-CRP浓度和Gensini积分呈负相关(r=-0.253,r=-0.162,P＜0.05),与HDL-C水平呈明显正相关(r=0.213,P＜0.01)。
结论:成功克隆了人gAPN基因,并表达出具有生物学活性的人gAPN重组蛋白;建立了一种简便、快捷、稳定、可靠的人血清APN定量ELISA检测方法;临床实验证明,CHD患者血清APN水平显著下降;血清APN浓度与hs-CRP浓度和Gensini积分呈负相关,与HDL-C水平呈正相关,低APN血症可作为判断CHD发病的一个指标,具有重要的临床应用前景。