用荧光激活的细胞分类仪检测调亡细胞
时间:2014-09-02 阅读:1143
1)原位缺口翻译检测裂解的dna段
1.取106经促调亡物质处理的细胞,用1% BSA-PBS洗涤细胞后加入0.1ml FITC标记的抗CD4或抗CD8单克隆抗体,4℃ 20分钟。用1% BSA-PBS洗涤细胞。置冰上。
2.加入0.1ml 1%多聚甲醛,置冰上5分钟,加入60%(v/v)甲醇溶液,轻轻悬浮细胞,4℃固定细胞15分钟。4℃离心500×g 10分钟,去上清液。
3.加入0.1ml 0.1% Triton X-100,4℃15分钟。用1% BSA-PBS洗涤细胞2次。加入50μl缺口翻译缓冲液(50mmol/L Tris-HCl pH7.4,5mmol/L MgCl2, 1.5U大肠杆菌DNA多聚酶I,50nmol/L 生物素-14-dUTP,50nmol/L dATP, 50nmol/L dGTP, 50nmol/L dCTP),37℃反应60分钟。用冷PBS洗涤细胞2次,悬浮于0.1ml预冷的1% BSA-PBS中。
4.加入10μl抗生素蛋白-PE,4℃ 30分钟,用冷PBS洗涤细胞。
5.上样于FACS仪,用FACScan LysisⅡ软件分析。可以同时了解调亡细胞的类型。
2)末端脱氧核苷酸转移酶检测法检测裂解的DNA段
1.在37℃,含10%小牛血清的RPMI-1640培养液中,用促调亡物质喜树碱处理人PBMC 4小时。或用10-5g/ml地塞米松处理小鼠胸腺细胞4小时。
2.取106经处理的细胞,用1% BSA-PBS洗涤细胞后加入0.1ml FITC标记的抗CD或抗CD8单克隆抗体,4℃ 20分钟。用冷1% BSA-PBS洗涤细胞2次。置冰上,加入0.1ml 1%多聚甲醛,4℃ 15分钟。用冷PBS洗涤细胞2次,加入冷70%(v/v)乙醇溶液,轻轻悬浮细胞,-20℃固定细胞24小时。4℃离心500×g 10分钟,去上清液。
3.用PBS洗涤细胞2次。加入50μl TdT反应液悬浮细胞,37℃反应30分钟。用PBS洗涤细胞2次,悬浮于0.1ml PBS中。
4.加入10μl抗生物素蛋白-TC或抗生物素蛋白-FITC,室温反应30分钟,用PBS洗涤细胞。
5.上样于FACS仪,分析调亡细胞的类型和调亡情况。
3)7-AAD染色法
1.取5×105经不同处理的细胞,用PBS洗涤细胞1次,加入10倍量PBS,离心500×g 5分钟,去上清液。
2.用0.5ml含20μg/ml 7-ADD的PBS悬浮细胞,4℃避光放置20分钟。
3.直接在FACS上用650nm滤光片检测红色荧光,用Lysis Ⅱ软件分析,可区分活细胞(R1)、早期调亡的细胞(R2)和后期调亡细胞/死细胞(R3)。
4)PI染色法
1.取2.5×105~3.5×105经不同处理的细胞,接种在24孔细胞培养板的各孔中,在37℃ 5% CO2饱和水汽二氧化碳培养箱中培养24~48小时。
2.每孔加50ml 100mg/ml PI。直接在FACS上用FL2滤光片检测红色荧光,用Lysis Ⅱ软件分析,可区分活细胞(R1,不着染)和死细胞(R2,着染)。
5)Annexin V、7-AAD(或PI)联合染色法
1.配制10倍浓缩的结合缓冲液:含140mmol/L NaCl, 25mmol/L CaCl2的0.1mol/L pH 7.0 Hepes/NaOH缓冲液,4℃保存,用前用双蒸水稀释10倍。
2.用预冷的PBS洗涤经不同处理的待测细胞,洗2次。用结合缓冲液将细胞配制1×106/ml。取0.1ml细胞悬液置5ml培养管中。
3.加入5μl AV-FITC,再加5μl 7-ADD或10μl PI。稍稍混悬细胞,置暗处,室温(20~25℃)15分钟。
4.立即加入0.4ml结合缓冲液,终止反应。立即在FACS上分析。注意设立对照:未经处理的细胞对照,排除自发调亡;不加染色剂的对照;只加AV的对照;只加7-ADD或PI的对照等。
6)溴乙啶/吖啶橙染色法
1.用细胞培养液将经不同处理的细胞配成5×106/ml。向25μl细胞悬液中加1μl溴乙啶/吖啶橙染液。室温中染色适当时间。
2.在荧光显微镜的高倍镜下计数活细胞和有异常染色质分布的细胞。吖啶橙着染调亡的细胞核,溴乙啶染色死亡的细胞,活细胞不被染色。