实验目的： 研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化RNA，RNA质
量的高低常常影响cDNA文库、RT-PCR、Northern Blot、点杂交及5’ RAGE等分子生物学实验的成败。
实验原理：Trizol是一种新型总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍和酚等物质，能迅速破
碎细胞和溶解细胞中的其它成分，抑制细胞释放出核酸酶，维持细胞中RNA的稳定，加入氯仿离心后，RNA进入水相，再用异丙醇沉淀水相中的RNA，即可达到提取总RNA的目的。
实验要求： 1.了解Trizol法分离总RNA的原理。
2.掌握从培养细胞中提取、分离总RNA的方法。
3.掌握RNA电泳检测胶的制备、电泳、染色及分析
实验步骤：
1. 物品的准备：
尽可能使用无菌、一次性塑料制品，已标明RNase-Free且未开封过的塑料制品，不必再进行其他处理，对于国产塑料制品，应按下列方法进行处理：
在一玻璃烧杯中注入含终浓度为0.1%DEPC的去离子水，将要处理的塑料制品浸泡其中12小时以上，弃DEPC水溶液，适温烘烤干燥已处理过的塑料制品，再经103.4kPa，121℃高压灭菌15分钟， 70-80℃烘烤干燥即可使用。氯仿、异丙醇、75%乙醇(用DEPC-treated Water)、RNase-free Water
2. 培养细胞总RNA的提取及分离：
1) 细胞的裂解 (起始量：1 x 106 )
方法 a：( 悬浮培养细胞 ) 800 g 离心 10 分钟后*弃上清。加入 1 mlTrizol Reagent，立即用移液器抽打 5 次。
方法 b：( 贴壁培养细胞 ) 将培养皿中的培养液*弃干净。将 1 mlTrizol Reagent 直接加在培养皿中的细胞上。将细胞并Trizol 一起移入eppendorf 离心管中。
2) 室温静置 5 分钟。再加入 0.25 ml 氯仿，用力颠倒离心管以混匀。静置 5 分钟后，以12000g的离心速度离心 10 分钟。
3) 小心将上层水相移至另一离心管中，再加入0.7倍体积的异丙醇，振荡混匀。室温放置 10 分钟。
4) 以12000g的离心速度离心 10 分钟。小心地弃上清。
5) 在离心管中加入 1ml 70% 乙醇(DEPC水新鲜配制)，颠倒混匀，离心 5 分钟。小心地弃上清。
6) 室温静置 5-15 分钟使 RNA 沉淀恰好干燥。加入50 ul RNase free H2O和 1-2 ul RNA 保护剂溶解 RNA。
混匀后取 1--5 ul 电泳，检测 RNA的完整性 (使用 DNA 电泳方式即可，但要使用进口分子生物学级别的Agarose。完整的 RNA 具备 28 S 条带的亮度> 18 S 条带的亮度之特点);取 1-5ul 测定 A260 值计算总 RNA 的量。剩下的 RNA 保存于冰上 (如果马上进行 mRNA 抽提)，或者-70 oC (如果不马上进行 mRNA 抽提)。如果电泳证明 RNA 是完整的，方可进行下面的 mRNA 纯化，否则重新开始抽提总 RNA。如果总 RNA 的 量 太低 (假定 mRNA 占总 RNA 量的1%)，使用更多的样品再抽提，以获得足够的总RNA。
3. 从总RNA中分离mRNA
利用成熟的mRNA的末端具有polyA尾的特点，合成一段Oligo(dT)引物，根据碱基互补配对的原则，可将mRNA从总RNA中分离出来。
注意事项：
RNase酶是导致RNA降解的zui主要的原因，它广泛存在于人的皮肤上，而RNase酶非常稳定，用常规的高压蒸汽灭菌方法和蛋白抑制剂都不能使RNase酶*失活，因此，实验时一定注意戴手套，同时所有的实验用具需经0.1%的DEPC水处理12小时以上，以去除RNase酶。
Trizol reagent、氯仿、DEPC水是剧毒物质，要注意防护。在吸取浓DEPC水，或用DEPC水处理塑料制品时，要注意在通风柜中进行。
实验中常见问题及原因分析：
RNA的产量低
可能的原因：
1) RNA溶解不*;
2) 离心速度过大(大于12000g);
3) 加入Trizol reagent后，匀质化不*，应在室温下放置一 段时间后，再加入氯仿。
RNA降解
可能的原因：
1) 加入Trizol reagent以前，细胞处理步骤过多，改正：弃尽上清，直接加入Trizol reagent，室温放置即可;
2) 不正确的储存方法：应存于-70°C，而不是-20°C。
A260/280少于1.65
可能的原因：
1) 加入Trizol reagent量不够，而使细胞匀质化不*;
溶解RNA的溶液偏酸。
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