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兔t-PA 免疫组化试剂盒

时间:2013-05-07      阅读:368

 兔t-PA 免疫组化试剂盒

该试剂盒以HRP 标记的链霉亲和素复合物(HRP Streptavidin
Conjugate,HRP-SA)为基础,可用于检测细胞、组织内的特异性t-PA
抗原。该试剂盒具有灵敏度高、特异性强、定性定位准确、背景清晰。
在所用的t-PA 一抗与相应靶抗原结合后,用生物化二抗与一抗特异
性结合,zui后加入HRP-SA,形成抗原—特异一抗—*化二抗—
HRP-SA 复合物,显微镜下观察成像。
注:本产品仅供实验室科学研究。本步骤是根据我们长期实验得出的
有效步骤,不一定是*方法,请客户根据具体科研实验情况进行调
整和优化,并欢迎客户和我们探讨。
试剂盒所含试剂:
试剂A 通透液:0.1% Triton-X 100 10 mL(选用)
试剂B Tween 20 5 mL
试剂C 封闭缓冲液(封闭用) 20 mL
试剂D (*分装)已稀释的即用型t-PA 一抗
试剂E (*分装)*化羊抗兔IgG 1 支
(浓度1.5 mg/mL,稀释比为1:300~1:500)50 μL+抗体稀释液20ml
试剂F HRP-SA 复合物1 支(浓度1 μM,稀释比1:50~1:200)100 μL
试剂G DAB 显色液
试剂F 缓冲甘油封固剂10 mL
用户自备试剂:
1. 10mM TBS(pH7.2~7.4)
三羟基氨基甲烷1.21g
氯化钠7.6g
加蒸馏水800mL,浓盐酸调pH 值至7.2~7.4,zui后定容至1000mL
TBS-T:TBS+Tween 20(0.05%体积比)
2.抗原修复液(依检测抗原不同而选择不同的修复液)
10mM pH6.0 柠檬酸缓冲液
柠檬酸0.38g
柠檬酸三钠2.45g
加蒸馏水900mL,浓盐酸调pH 值至6.0,zui后定容至1000mL
或:0.5M EDTA 修复液(pH8.0)
EDTA·2H2O 186.1g
柠檬酸三钠2.45g
加蒸馏水700mL,用10mM NaOH 调pH 值至8.0,zui后定容至1000Ml
石蜡包埋组织切片免疫染色
实验步骤(建议方案):
石蜡包埋组织切片3~4μm 厚度
1.烤片: 将待做切片置于切片架上,于60℃恒温烤箱中至少烤1 hr;
2.脱蜡: 切片放入盛有二甲苯的容器中脱蜡3 次(即二甲苯Ⅰ、Ⅱ、
Ⅲ),每次10 min;
3.水化: 切片经下行酒精水化,无水乙醇5min,95%乙醇2 次(每
次2min),85%乙醇2 min;75%乙醇2min,自来水冲洗,ddH2O 洗
2×2min;
4.抗原修复: 根据抗体说明书推荐方法进行抗原修复,常采用高压、
微波(温度达到98~100℃)或酶消化修复法,室温自然冷却,自来
水冲洗,ddH2O 洗2×2min,TBS 洗涤(2×2min)(具体修复方法见
附1)* 注:有些抗原勿需修复,直接进入第5 步封闭。
5.封闭: 滴加试剂C,37℃湿盒孵育30 min;
6.加一抗:滴加用试剂D(即用型一抗),37℃湿盒孵育2 hr 或4℃
过夜;
7.洗涤: TBS-T 洗涤(3×5 min);
8.封闭: 滴加试剂C,37℃湿盒孵育10 min;
9.加二抗: 滴加用抗体稀释液稀释的*化二抗(试剂E),37℃
湿盒中孵育30 min;
10.洗涤: TBS-T 洗涤(3×5 min);
11.封闭: 滴加试剂C,37℃湿盒孵育封闭20 min;
12.加HRP-SA: 滴加用试剂D 稀释的试剂F(1:50~200,终浓度
5~20 nM),37℃湿盒中孵育30 min;
13.洗涤: TBS-T 洗涤(3×5 min),TBS 洗涤(2×5 min);
14.显色:应用DAB 溶液(试剂G)显色;
15.复染:自来水充分冲洗,复染,脱水,透明;
16.封片: 待组织标本干后,用试剂F 封片;
17.观察成像: 显微镜下观察成像。
注意事项:
1. 修复后缓冲液须自然冷却,自来水冲洗后方能把切片取出,骤冷
有可能导致结晶或抗原封闭。
2. 缓冲液的量必须保证所有切片都能浸泡到,用过的柠檬酸缓冲液
不能反复使用。
3. 若试剂为微量浓缩液,用前应低速离心,将内盖和管壁附着的溶
液离到底部。
4. 封片前一定要换用TBS 充分洗涤,以便洗去组织上残留的Tween
20,否则会影响结果观察。
5. 如须复染细胞核,则在封片前复染或直接采用含有染核试剂的封
片剂进行封片。
附1:抗原修复方法
常用抗原修复液:柠檬酸缓冲液(0.01M pH6.0)、EDTA 抗原修复液
(pH8.0 或9.0)等等。
一、酶消化修复法
切片脱蜡水化处理,TBS 冲洗,在组织上滴加*或*,
37℃孵育20~30min 后TBS 冲洗即可。
二、微波抗原修复法
微波盒中加入抗原修复液微波加热至沸腾,将脱蜡水化后的切片置于
耐高温塑料切片架上,放入已沸腾的缓冲液中,中档或继续微波
10~15min,取出微波盒冷却至室温后,自来水冲洗,取出切片。因不
同微波炉微波处理时间存在差异,须自行调整。
三、直接高压抗原修复法
取修复液于不锈钢高压锅中加热至沸腾,将组织切片置于耐高温切片
架上,修复液沸腾后放入切片架,盖上锅盖,待喷气后计时1.5~2.5min
即可脱离热源,自然冷却至室温后自来水冲洗,取出切片。此方法适
用于较难检测或核抗原的修复。
四、隔水式高压抗原修复法
不锈钢高压锅中加自来水加热至沸腾,微波盒中加入修复液于微波炉
中加热至沸腾,将切片放入微波盒中,再将微波盒放入高压锅中盖上
锅盖,待喷气后计时4~8 min 即可关闭热源,自然冷却至室温后自来
水冲洗,取出切片。此方法适用于较难检测或核抗原的修复。
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