兔t-PA 免疫组化试剂盒
时间：2013-05-07 阅读：364
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上海瑞齐实业科技有限公司 -
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兔t-PA 免疫组化试剂盒
该试剂盒以HRP 标记的链霉亲和素复合物（HRP Streptavidin
Conjugate，HRP-SA）为基础，可用于检测细胞、组织内的特异性t-PA
抗原。该试剂盒具有灵敏度高、特异性强、定性定位准确、背景清晰。
在所用的t-PA 一抗与相应靶抗原结合后，用生物化二抗与一抗特异
性结合，zui后加入HRP-SA，形成抗原—特异一抗—*化二抗—
HRP-SA 复合物，显微镜下观察成像。
注：本产品仅供实验室科学研究。本步骤是根据我们长期实验得出的
有效步骤，不一定是*方法，请客户根据具体科研实验情况进行调
整和优化，并欢迎客户和我们探讨。
试剂盒所含试剂：
试剂A 通透液：0.1% Triton-X 100 10 mL（选用）
试剂B Tween 20 5 mL
试剂C 封闭缓冲液（封闭用） 20 mL
试剂D （*分装）已稀释的即用型t-PA 一抗
试剂E （*分装）*化羊抗兔IgG 1 支
（浓度1.5 mg/mL，稀释比为1:300~1:500）50 μL+抗体稀释液20ml
试剂F HRP-SA 复合物1 支（浓度1 μM，稀释比1:50~1:200）100 μL
试剂G DAB 显色液
试剂F 缓冲甘油封固剂10 mL
用户自备试剂：
1． 10mM TBS（pH7.2~7.4）
三羟基氨基甲烷1.21g
氯化钠7.6g
加蒸馏水800mL，浓盐酸调pH 值至7.2~7.4，zui后定容至1000mL
TBS-T：TBS+Tween 20（0.05%体积比）
2．抗原修复液（依检测抗原不同而选择不同的修复液）
10mM pH6.0 柠檬酸缓冲液
柠檬酸0.38g
柠檬酸三钠2.45g
加蒸馏水900mL，浓盐酸调pH 值至6.0，zui后定容至1000mL
或：0.5M EDTA 修复液（pH8.0）
EDTA·2H2O 186.1g
柠檬酸三钠2.45g
加蒸馏水700mL，用10mM NaOH 调pH 值至8.0，zui后定容至1000Ml
石蜡包埋组织切片免疫染色
实验步骤（建议方案）：
石蜡包埋组织切片3~4μm 厚度
1.烤片： 将待做切片置于切片架上，于60℃恒温烤箱中至少烤1 hr；
2.脱蜡： 切片放入盛有二甲苯的容器中脱蜡3 次（即二甲苯Ⅰ、Ⅱ、
Ⅲ），每次10 min；
3.水化： 切片经下行酒精水化，无水乙醇5min，95%乙醇2 次（每
次2min），85%乙醇2 min；75%乙醇2min，自来水冲洗，ddH2O 洗
2×2min；
4.抗原修复： 根据抗体说明书推荐方法进行抗原修复，常采用高压、
微波（温度达到98~100℃）或酶消化修复法，室温自然冷却，自来
水冲洗，ddH2O 洗2×2min，TBS 洗涤（2×2min）（具体修复方法见
附1）* 注：有些抗原勿需修复，直接进入第5 步封闭。
5.封闭： 滴加试剂C，37℃湿盒孵育30 min；
6.加一抗：滴加用试剂D（即用型一抗），37℃湿盒孵育2 hr 或4℃
过夜；
7.洗涤： TBS-T 洗涤（3×5 min）；
8.封闭： 滴加试剂C，37℃湿盒孵育10 min；
9.加二抗： 滴加用抗体稀释液稀释的*化二抗（试剂E），37℃
湿盒中孵育30 min；
10.洗涤： TBS-T 洗涤（3×5 min）；
11.封闭： 滴加试剂C，37℃湿盒孵育封闭20 min；
12.加HRP-SA： 滴加用试剂D 稀释的试剂F（1：50~200，终浓度
5~20 nM），37℃湿盒中孵育30 min；
13.洗涤： TBS-T 洗涤（3×5 min），TBS 洗涤（2×5 min）；
14.显色：应用DAB 溶液（试剂G）显色；
15.复染：自来水充分冲洗，复染，脱水，透明；
16.封片： 待组织标本干后，用试剂F 封片；
17.观察成像： 显微镜下观察成像。
注意事项：
1. 修复后缓冲液须自然冷却，自来水冲洗后方能把切片取出，骤冷
有可能导致结晶或抗原封闭。
2. 缓冲液的量必须保证所有切片都能浸泡到，用过的柠檬酸缓冲液
不能反复使用。
3. 若试剂为微量浓缩液，用前应低速离心，将内盖和管壁附着的溶
液离到底部。
4. 封片前一定要换用TBS 充分洗涤，以便洗去组织上残留的Tween
20，否则会影响结果观察。
5. 如须复染细胞核，则在封片前复染或直接采用含有染核试剂的封
片剂进行封片。
附1：抗原修复方法
常用抗原修复液：柠檬酸缓冲液（0.01M pH6.0）、EDTA 抗原修复液
（pH8.0 或9.0）等等。
一、酶消化修复法
切片脱蜡水化处理，TBS 冲洗，在组织上滴加*或*，
37℃孵育20~30min 后TBS 冲洗即可。
二、微波抗原修复法
微波盒中加入抗原修复液微波加热至沸腾，将脱蜡水化后的切片置于
耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，中档或继续微波
10~15min，取出微波盒冷却至室温后，自来水冲洗，取出切片。因不
同微波炉微波处理时间存在差异，须自行调整。
三、直接高压抗原修复法
取修复液于不锈钢高压锅中加热至沸腾，将组织切片置于耐高温切片
架上，修复液沸腾后放入切片架，盖上锅盖，待喷气后计时1.5~2.5min
即可脱离热源，自然冷却至室温后自来水冲洗，取出切片。此方法适
用于较难检测或核抗原的修复。
四、隔水式高压抗原修复法
不锈钢高压锅中加自来水加热至沸腾，微波盒中加入修复液于微波炉
中加热至沸腾，将切片放入微波盒中，再将微波盒放入高压锅中盖上
锅盖，待喷气后计时4~8 min 即可关闭热源，自然冷却至室温后自来
水冲洗，取出切片。此方法适用于较难检测或核抗原的修复。