一、为什么所有试剂和检测样本要平衡至室温后再进行加样操作？

温度是ELISA试剂盒结合反应的重要影响因素。为了使所有样本在一致的温度下反应，实验前务必将所有试剂平衡至室温，包括检测样本。避免因温度的动力学反应差异而导致ELISA检测结果的不准确。

二、如何获得良好线性的标准曲线？

按照推荐方式保存标准品；溶解标准品之前需短暂离心，收集粉末；确保标准品溶解和混匀（大约10min），然后再进行后续的系列稀释步骤，确保每一步都充分混匀且精确移液；显色的恰当终止；选择合适的数学拟合方程绘制标准曲线。

三、ELISA实验为什么必须设置复孔？

为获得更准确的实验结果，强烈建议标准品及样本进行复孔检测。因为复孔检测可以：

计算平均值，确保实验结果更准确；

解决实验中误操作造成的跳孔现象；

计算CV值，对实验的操作和试剂盒的精密度进行评估。

四、为什么实验过程中孵育、洗涤需要振荡？如何振荡？

振荡孵育使反应更充分，振荡洗涤使背景更干净。建议使用酶标专用96孔微孔板振荡器。

孵育过程振荡，可以加快、加强抗原抗体分子间的相互碰撞接触，使得反应过程更加完善，OD值通常会比未振荡孵育的结果要高；洗涤过程振荡，可以使洗板更干净，在很大程度上 能降低背景值，同时可以提高试剂盒检测的灵敏度。

五、何时终止ELISA反应？

ELISA实验终需要酶催化底物显色反应来完成，在佳时间终止反应是ELISA试剂盒实验成功的重要因素。在HRP-TMB酶促反应系统中，S5出现淡蓝色，S1 – S3有明显的阶梯型蓝色，便需要终止反应；或者根据浓度标准品孔在620nm的OD值来决定，OD620=0.9-0.95之间时即可终止。

六、为什么酶标仪读数时必须选用双波长？

首先，酶标仪使用前务必预热10-15min，使测读结果更稳定。其次，ELISA实验采用双波长测定吸光度，可以排除单波长检测时的测定干扰（标本的浓度，干扰色等）。一般采用大波长作为参照波长，在参照波长下，检测物的吸光值小，检测波长和参照波长的吸光值之差可以消除非特异性吸收；因此，双波长测定，可大限度的消除指纹、杂质及不透光的物质对酶标仪读数带来的误差，以保证实验数据的准确度。