人单核细胞增多性李斯特菌素O（（LLO）测定盒北京代测

人单核细胞增多性李斯特菌素O((LLO)测定盒北京代测

中文名称：人单核细胞增多性李斯特菌素O((LLO)测定盒北京代测

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本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人单核细胞增多性李斯特菌素O((LLO)测定盒北京代测水平。用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入，再与HRP标记的结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过*洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成zui终的黄色。颜色的深浅和样品中的呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中的浓度。

显色和比色（一） 显色显色是ELISA中的zui后一步温育反应，此时酶催化无色的底物生成有色的产物。反应的温度和时间仍是影响显色的因素。在一定时间内，阴性孔可保持无色，而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。适当提高温度有助于加速显色进行。在定量测定中，加入底物后的反应温度和时间应按规定力求准确。定性测定的显色可在室温进行，时间一般不需要严格控制，有时可根据阳性对照孔和阴性对照孔的显色适当缩短或延长反应时间，及时判断。OPD底物显色一般在室外温或37℃反应20-30分钟后即不再加深，再延长反应时间，可使本底值增高。OPD底物液受光照会自行变色，显色反应应避光进行，显色反应结束时加入终止液终止反应。OPD产物用硫酸终止后，显色由橙黄色转向棕黄色。TMB受光照的影响不大，可在室温中置于操作台上，边反应观察结果。但为保证实验结果的稳定性，宜在规定的适当时间阅读结果。TMB经HRP作用后，约40分钟显色达，随即逐渐减弱，至2小时后即可*消退至无色。TMB的终止液有多种，叠氮钠和十二烷基*（SDS）等酶抑制剂均可使反应终止。这类终止剂尚能使蓝色维持较长时间（12-24小时）不褪，是目视判断的良好终止剂。此外，各类酸性终止液则会使蓝色转变成黄色，此时可用特定的波长（450nm）测读吸光值。（二）比色比色前应先用洁净的吸水纸拭干板底附着的液体，然后将板正确放入酶标比色仪的比色架中。以软板为载体的试验，需先将板置于标准96孔的座架中，才可进行比色。在加底物液显色前，先将软板边缘剪净，这样，此板就可*平妥坐入座架中。 比色时应先以蒸馏水校零点，测读底物孔（未经任何反应仅加底物液的孔）和空白孔（以生理盐水或稀释液代替标本作全过程的孔），以记录本次试验的试剂状况。其后可用空白孔以蒸馏水校零点，以上各孔的吸光度需减去空白孔的吸光度，然后进行计算。比色结果的表达以往通用光密度（oplical density，OD），现按规定用吸光度（absorbence，A），两者含义相同。通常的表示方法是，将吸收波长写于A字母的右下角，如OPD的吸收波长为492nm，表示方法为"A492nm"或"OD492nm"。（三） 酶标仪酶标比色仪简称酶标仪，通常指于测读ELISA结果吸光度的光度计。针对固相载体形式的不同，各有特制的适用于板、珠和小试管的设计。许多试剂公司配套供应酶标仪。酶标仪的主要性能指标有：测读速度、读数的准确性、重复性、精确度和可测范围、线性等等。优良的酶标仪的读数一般可精确到0.001，准确性为±1%，重复性达0.5%。举例说，若某孔测得的A值为1.083，则该孔相对于空气的真实A值应为1.083±0.01（1.073~1.093），重复测定数次，其A值均应1.083±0.05（1.078~1.088）在之间。酶标仪的可测范围视各酶标仪的性能而不同。普通的酶标仪在0.000~2.000，新型号的酶标仪上限拓宽达2.900，甚至更高。超出可测上限的A值常以"*"或"over"或其它符号表示。应注意可测范围与线性范围的不同，线性范围常小于可测范围，比如某一酶标仪的可测范围为0.000~2.900，而其线性范围仅0.000~2.000，这在定量ELISA中制作标准曲线时应予注意。酶标仪不应安置在阳光或强光照射下，操作时室温宜在15~30℃，使用前先预热仪器15-30分钟，测读结果更稳定。测读A值时，要选用产物的敏感吸收峰，如OPD用492nm波长。有的酶标仪可用双波长式测读，即每孔先后测读两次，*次在zui适波长（W1），第二次在不敏感波长（W2），两次测定间不移动ELISA板的位置。例如OPD用492nm为W1，630nm为W2，zui终测得的A值为两者之差（W1-W2）。双波长式测读可减少由容器上的划痕或指印等造成的光干扰。各种酶标仪性能有所不同，使用中应详细新闻记者说明书。

标本的采取和保存可用作ELISA测定的标本十分广泛，体液（如血清）、分泌物（唾液）和排泄物（如尿液、粪便）等均可作标本以测定其中某种抗体或抗原成份。有些标本可直接进行测定（如血清、尿液），有些则需经预处理（如粪便和某些分泌物）。大部分ELISA检测均以血清为标本。血浆中除尚含有纤维蛋白原和抗凝剂外，其他成份均同等于血清。制备血浆标本需借助于抗凝剂，而血清标本只要待血清自然凝固、块收缩后即可取得。除特殊情况外，在医学检验中均以血清作为检测标本。在ELISA中血浆和血清可同等应用。血清标本可按常规方法采集，应注意避免溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以HRP为标记的ELISA测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色。血清标本宜在新鲜时检测。如有细菌污染，菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应。如在冰箱中保存过久，其中的可发生聚合，在间接法ELISA中可使本底加深。一般说来，在5天内测定的血清标本可放置于4℃，超过一周测定的需低温冰存。冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混匀宜轻缓，避免气泡，可上下颠倒混和，不要在混匀器上强烈振荡。混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测。反复冻融会使抗体效价跌落，所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冰存。保存血清自采集时就应注意无菌操作，也可加入适当防腐剂。

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