Wilkins-Chalgren 厌氧菌琼脂

Wilkins-Chalgren 厌氧菌琼脂特殊培养法

二倍体细胞培养法与一般培养相同，关键在于传代，其传代程序为：

1.吸除旧培养液注入另瓶中。

2.用温BSS冲洗1次。

3.用0.25%温*消化，加入消化液量以仅覆盖细胞层即可；作用1~5分钟。

4.待细胞附着松动、细胞质边缘卷起和间隔加大，便终止消化。为防止细胞丢失,可不必再用BSS冲洗,直接向瓶中加入培养液（新旧培养液按2：1新旧混合）。

5.轻轻反复吹打制成单个细胞悬液。

6.按一分为二比例接种培养。

使用饲细胞(Feeder Cells)。制备方法：

1.取原代培养的人或动物胚胎成纤维细胞，90%汇合时制成细胞悬液，再按105细胞/毫升重新接种培养。

2.在细胞半汇合时，准备0.25μg/ml的丝裂霉素C，按2μg/106细胞的量加入到培养瓶中过夜；或用射线单次照射，剂量30～50戈瑞。

3.细胞经上述处理后，Hanks液漂洗两次、更换培养液、再培养24小时，*消化细胞制成悬液，按5×104（104细胞/cm2）接种入新Wilkins-Chalgren 厌氧菌琼脂中。

4.48小时后，即可用于细胞克隆之用。

Wilkins-Chalgren 厌氧菌琼脂细胞分离（克隆）培养

多孔塑料培养板单细胞克隆法：

1.消化：取健康待克隆细胞，吸出瓶内培养液，加消化液。

2.低密度细胞悬液的制备：做克隆细胞时首先需先用消化法制备出分散成单个细胞悬液，然后稀释细胞，使之成为1~2细胞/毫升悬液，zui适宜细胞密度为1~2细胞/ml培养液。

3.接种：先用吸管轻轻吹打细胞悬液，使混悬均匀，继用加样器向塑料培养板每孔内加0.5毫升。接种时要迅速准确，争取在zui短时间内加完，以免培养液蒸发，然后迅速盖好盖板，置CO2温箱培养。

4.标记：培养6~12小时后，待细胞下沉冰贴附于培养板孔底后，从温箱中取出，置倒置光显微镜台上，观察和标记下含有单个细胞的孔，置CO2温箱培养。在培养中一般无需换液，只有在细胞增长过于缓慢时才可进行换液。换液时先吸除旧培养基，但不要吸除过多，余少许，以免细胞干涸。然后再迅速补加新鲜克隆培养液，继续培养3~4周。待孔内细胞增至500~600个时，可进行分离培养。

5.分离扩大培养：培养86~96小时后进行观察。挑选生长良好的单细胞克隆孔，先吸除旧培养液，用Hanks洗1~2次，继加*少许，加入量已能覆盖细胞群即可，如过多，应吸除多余消化液。置于倒置显微镜下窥视，待发现细胞变圆时，加入0.1ml含10%血清的克隆培养基，用吸管轻轻吹打，当细胞离开底物悬浮后，一并吸入管内，移入另瓶或皿中，再补加一定量克隆培养液，置CO2温箱中继续培养、增殖，使之形成新的细胞群后，即转用常规培养法培养。

Wilkins-Chalgren 厌氧菌琼脂相关产品如下：hz1221    含铁牛奶培养基    250g    用于产气荚膜梭菌的牛奶发酵试验
hz1222    梭菌鉴别琼脂（DCA）    250g    用于干燥食品亚硫酸盐还原梭菌的计数和培养
hz1223    强化梭菌鉴别琼脂（DRCA）    250g    用于食品和其它物质中梭菌的计数和培养（MERCK方法）
hz1224    强化梭菌琼脂    250g    用于梭菌的分离培养
hz1225    强化梭菌培养基（RCM）    250g    用于梭菌的分离培养
hz1226    TSN琼脂    250g    用于产气荚膜梭菌的平板计数
hz1227    TBB培养基    250g    用于乳酪产品中梭菌的计数
hz1228    CHO培养基基础    250g    用于厌氧菌的糖生化反应
hz1229    SCHAEDLER琼脂    250g    用于厌氧菌的分离培养
hz1230    厌氧菌琼脂    250g    用于厌氧菌的分离培养
hz1231    CDC厌氧菌琼脂    250g    用于厌氧菌的分离培养
hz1232    WILKINS-CHALGREN琼脂    250g    用于厌氧菌的分离培养
hz1233    MCP琼脂    250g    用于产气荚膜梭菌的计数和培养
hz1234    SC琼脂基础    250g    用于产气荚膜梭菌的计数和培养，需天极D-环*和50%卵黄乳液（ISO标准）
hz1235    明胶磷酸盐缓冲液    250g    用于检测肉毒梭菌时样品稀释液
hz1236    梭菌属测定用培养基    250g    用于梭菌属细菌检测
弯曲杆菌检验培养基            
hz1241    布氏琼脂    250g    用于弯曲杆菌分离(SN标准)
hz1242    布氏肉汤    250g    用于弯曲杆菌增菌肉汤和布氏琼脂制备(SN标准)
hz1243    改良Skirrow氏琼脂基础    250g    用于弯曲杆菌的分离培养
hz1244    改良Camp-BAP氏琼脂基础    250g    用于弯曲杆菌选择性分离培养(GB标准)
hz1245    TTC琼脂基础    250g    用于弯曲杆菌的TTC试验（GB标准）
hz1246    *培养基    250g    用于弯曲杆菌*耐受性试验（GB标准）
hz1247    快速硫化氢试验琼脂    250g    用于弯曲杆菌的硫化氢试验（GB标准）
hz1248    DNA酶甲基绿琼脂基础    100    用于弯曲杆菌的DNA酶水解试验（GB标准）
hz1249    马尿酸钠培养基    250g    用于弯曲杆菌的马尿酸钠水解试验（GB标准）
hz1250    波尔顿选择性增菌肉汤    250g    用于弯曲杆菌选择性增菌培养
hz1251    CCDA基础    250g    用于弯曲杆菌分离培养（WHO方法）
hz1252    Campy-Cefex琼脂基础    250g    用于弯曲杆菌分离培养（FDA方法）
hz1253    改良CCD琼脂基础(mCCD)    250g    用于弯曲杆菌的分离培养（GB2008标准）
hz1254    Bolton肉汤    250g    用于空肠弯曲菌的增菌（GB2008标准）
hz1255    Mueller-Hinton琼脂（MHA）    250g    用于弯曲杆菌的药物敏感性试验
hz1256    哥伦比亚血琼脂基础    250g    用于弯曲杆菌的纯化培养
hz1257    Preston肉汤基础    250g    用于空肠弯曲杆菌的选择性增菌
小肠结肠炎耶尔森氏菌检验培养基