改良GAM 琼脂基础

改良GAM 琼脂基础特殊培养法

二倍体细胞培养法与一般培养相同，关键在于传代，其传代程序为：

1.吸除旧培养液注入另瓶中。

2.用温BSS冲洗1次。

3.用0.25%温*消化，加入消化液量以仅覆盖细胞层即可；作用1~5分钟。

4.待细胞附着松动、细胞质边缘卷起和间隔加大，便终止消化。为防止细胞丢失,可不必再用BSS冲洗,直接向瓶中加入培养液（新旧培养液按2：1新旧混合）。

5.轻轻反复吹打制成单个细胞悬液。

6.按一分为二比例接种培养。

使用饲细胞(Feeder Cells)。制备方法：

1.取原代培养的人或动物胚胎成纤维细胞，90%汇合时制成细胞悬液，再按105细胞/毫升重新接种培养。

2.在细胞半汇合时，准备0.25μg/ml的丝裂霉素C，按2μg/106细胞的量加入到培养瓶中过夜；或用射线单次照射，剂量30～50戈瑞。

3.细胞经上述处理后，Hanks液漂洗两次、更换培养液、再培养24小时，*消化细胞制成悬液，按5×104（104细胞/cm2）接种入新改良GAM 琼脂基础中。

4.48小时后，即可用于细胞克隆之用。

改良GAM 琼脂基础细胞分离（克隆）培养

多孔塑料培养板单细胞克隆法：

1.消化：取健康待克隆细胞，吸出瓶内培养液，加消化液。

2.低密度细胞悬液的制备：做克隆细胞时首先需先用消化法制备出分散成单个细胞悬液，然后稀释细胞，使之成为1~2细胞/毫升悬液，zui适宜细胞密度为1~2细胞/ml培养液。

3.接种：先用吸管轻轻吹打细胞悬液，使混悬均匀，继用加样器向塑料培养板每孔内加0.5毫升。接种时要迅速准确，争取在zui短时间内加完，以免培养液蒸发，然后迅速盖好盖板，置CO2温箱培养。

4.标记：培养6~12小时后，待细胞下沉冰贴附于培养板孔底后，从温箱中取出，置倒置光显微镜台上，观察和标记下含有单个细胞的孔，置CO2温箱培养。在培养中一般无需换液，只有在细胞增长过于缓慢时才可进行换液。换液时先吸除旧培养基，但不要吸除过多，余少许，以免细胞干涸。然后再迅速补加新鲜克隆培养液，继续培养3~4周。待孔内细胞增至500~600个时，可进行分离培养。

5.分离扩大培养：培养86~96小时后进行观察。挑选生长良好的单细胞克隆孔，先吸除旧培养液，用Hanks洗1~2次，继加*少许，加入量已能覆盖细胞群即可，如过多，应吸除多余消化液。置于倒置显微镜下窥视，待发现细胞变圆时，加入0.1ml含10%血清的克隆培养基，用吸管轻轻吹打，当细胞离开底物悬浮后，一并吸入管内，移入另瓶或皿中，再补加一定量克隆培养液，置CO2温箱中继续培养、增殖，使之形成新的细胞群后，即转用常规培养法培养。

改良GAM 琼脂基础相关产品如下：hz1194    叠氮钠葡萄糖肉汤    250g    用于链球菌的增菌培养
    Aziode Dextrose Broth        
hz1195    乙基紫叠氮钠肉汤    250g    用于链球菌的增菌培养
    Ethyl Violet Aziode Broth        
hz1196    KF链球菌琼脂    100g    用于链球菌的选择性分离及计数（SN标准）
    KF Streptococcus Agar        
阪崎肠杆菌检验培养基            
hz1075    缓冲蛋白胨水（BPW）    250g    用于阪崎杆菌前增菌培养（GB2008标准）
    Buffered Peptone Water        
hz1014    胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）    250g    用于奶粉中阪崎杆菌的纯化培养和产黄色素试验(GB2008、SN标准)
    Tryptic Soy Agar        
hz1020    脑心浸出液肉汤    250g    用于细菌的增菌培养
    Brain Heaet Infusion Broth        
hz1201    改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-*（mLST-Vm）    250g    用于阪崎杆菌选择性增菌培养（GB2008标准）
    Modifield Lauryl Sulfate Tryptose Broth        
hz1818    阪崎肠杆菌显色培养基（DFI琼脂）    1000ml    用于阪崎杆菌的显色培养，阪崎杆菌显蓝色，其它肠杆菌显无色。
    Chromogenic Enterbacter Sakazakii Agar        
hz1202    结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂（VRBGA）    250g    用于奶粉中阪崎杆菌的分离培养(FDA、SN方法)
    Violet Red Bile Glucose Agar        
hz1050    肠道菌增菌肉汤(EE)     250g    用于肠道菌的增菌培养(FDA、SN 标准)
    Enterobacteria Enrichment Broth        
hz1051    西蒙氏枸橼酸盐琼脂     250g    用于肠道菌的柠檬酸盐利用试验(GB标准)
    Simmons Citrate Agar        
产气荚膜梭菌、肉毒梭菌、厌氧菌检验培养基            
hz1211    胰月示-亚硫酸盐-环*琼脂基础（TSC）    250g    用于产气荚膜梭菌的平板计数(SN标准)
hz1212    产芽孢肉汤    250g    用于产气荚膜梭菌的产芽孢培养(SN标准)
hz1213    亚硫酸盐-多粘菌素-*琼脂基础    250g    用于产气荚膜梭菌的平板计数(GB标准)
hz1214    多价蛋白胨-酵母膏（PY）培养基    250g    用于产气荚膜梭菌的培养(SN标准)
hz1215    疱肉培养基基础    250g    加入牛肉粒,用于肉毒梭菌及厌氧梭状芽孢杆菌的检验(GB标准)
hz1216    疱肉牛肉粒    100g    加入疱肉基础中，配成疱肉培养基
hz1017    液体硫乙醇酸盐培养基    250g    用于产气荚膜梭菌确证试验的细菌培养(GB.SN标准)
hz1218    卵黄琼脂培养基基础    250g    用于肉毒梭菌、产气荚膜梭菌的分离培养（GB标准）
hz1219    动力-硝酸盐培养基    250g    用于产气荚膜梭菌的动力试验