GAM 半固体培养基

GAM 半固体培养基特殊培养法

二倍体细胞培养法与一般培养相同，关键在于传代，其传代程序为：

1.吸除旧培养液注入另瓶中。

2.用温BSS冲洗1次。

3.用0.25%温*消化，加入消化液量以仅覆盖细胞层即可；作用1~5分钟。

4.待细胞附着松动、细胞质边缘卷起和间隔加大，便终止消化。为防止细胞丢失,可不必再用BSS冲洗,直接向瓶中加入培养液（新旧培养液按2：1新旧混合）。

5.轻轻反复吹打制成单个细胞悬液。

6.按一分为二比例接种培养。

使用饲细胞(Feeder Cells)。制备方法：

1.取原代培养的人或动物胚胎成纤维细胞，90%汇合时制成细胞悬液，再按105细胞/毫升重新接种培养。

2.在细胞半汇合时，准备0.25μg/ml的丝裂霉素C，按2μg/106细胞的量加入到培养瓶中过夜；或用射线单次照射，剂量30～50戈瑞。

3.细胞经上述处理后，Hanks液漂洗两次、更换培养液、再培养24小时，*消化细胞制成悬液，按5×104（104细胞/cm2）接种入新GAM 半固体培养基中。

4.48小时后，即可用于细胞克隆之用。

GAM 半固体培养基细胞分离（克隆）培养

多孔塑料培养板单细胞克隆法：

1.消化：取健康待克隆细胞，吸出瓶内培养液，加消化液。

2.低密度细胞悬液的制备：做克隆细胞时首先需先用消化法制备出分散成单个细胞悬液，然后稀释细胞，使之成为1~2细胞/毫升悬液，zui适宜细胞密度为1~2细胞/ml培养液。

3.接种：先用吸管轻轻吹打细胞悬液，使混悬均匀，继用加样器向塑料培养板每孔内加0.5毫升。接种时要迅速准确，争取在zui短时间内加完，以免培养液蒸发，然后迅速盖好盖板，置CO2温箱培养。

4.标记：培养6~12小时后，待细胞下沉冰贴附于培养板孔底后，从温箱中取出，置倒置光显微镜台上，观察和标记下含有单个细胞的孔，置CO2温箱培养。在培养中一般无需换液，只有在细胞增长过于缓慢时才可进行换液。换液时先吸除旧培养基，但不要吸除过多，余少许，以免细胞干涸。然后再迅速补加新鲜克隆培养液，继续培养3~4周。待孔内细胞增至500~600个时，可进行分离培养。

5.分离扩大培养：培养86~96小时后进行观察。挑选生长良好的单细胞克隆孔，先吸除旧培养液，用Hanks洗1~2次，继加*少许，加入量已能覆盖细胞群即可，如过多，应吸除多余消化液。置于倒置显微镜下窥视，待发现细胞变圆时，加入0.1ml含10%血清的克隆培养基，用吸管轻轻吹打，当细胞离开底物悬浮后，一并吸入管内，移入另瓶或皿中，再补加一定量克隆培养液，置CO2温箱中继续培养、增殖，使之形成新的细胞群后，即转用常规培养法培养。

GAM 半固体培养基相关产品如下：乳酸菌、双歧杆菌检测培养基            
hz1135    改良番茄汁培养基基础    250g    用于食品中乳酸菌总数测定（使用时需另加番茄汁）
    Tomato Juice Agar， Modified        
hz1136    改良MC培养基    250g    用于食品中乳酸菌总数测定
    Chalmers Agar ，Modified        
hz1137    MRS肉汤（MRS）    250g    用于食品中乳酸菌测定
    MRS Broth        
hz1138    MRS琼脂（MRSA）    250g    用于乳酸菌的分离、计数和培养
    MRS Agar        
hz1139    BBL琼脂培养基    250g    用于食品中双歧杆菌分离培养
    BBL Agar Medium         
hz1140    *锂盐改良MRS培养基    250g    用于食品中乳酸菌测定
    Li Mupirocin Modified MRS Agar        
hz1141    TPY琼脂培养基    250g    用于食品中双歧杆菌分离培养
    TPY Medium        
hz1142    PYG液体培养基基础    250g    用于双歧杆菌增菌培养
    PYG Broth Base        
hz1143    乳酸杆菌选择性琼脂    250g    用于乳酸杆菌检测和分离培养
    Lactobacillus Selective Agar        
hz1144    乳酸杆菌肉汤培养基    250g    用于乳酸杆菌检测和分离培养
    Lactobacillus Broth        
hz1145    M17培养基    250g    用于乳酸链球菌和嗜热链球菌的选择计数
    M17 Medium        
弧菌检测培养基            
hz1151    碱性蛋白胨水（APW）    250g    用于霍乱弧菌选择性增菌培养（SN标准）
    Alkaline Peptone Water        
hz1152    TCyb琼脂    250g    用于致病性弧菌的选择性分离（GB，SN标准）
    Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose Agar        
hz1153    氯化钠*肉汤基础（SCPB）    250g    用于副溶血性弧菌选择性增菌培养，用前应无菌加入*（SN标准）
    Sodium Chloride Polymyxin Broth Base        
hz1154    *琼脂    250g    用于霍乱弧菌选择性分离培养
    Gentamycin Agar