50T 芝麻源性成分探针法荧光定量PCR试剂盒

特点：
1. 即开即用，用户只需要提供病毒样品。
2. 根据芝麻源性成分保守序列设计的专一性引物，与相关病毒无交叉反应。
3. 灵敏度可以达到几百拷贝/反应。
4. 一管式荧光定量 PCR 检测，避免后续污染。
5. 本试剂盒足够 50 次 20μL 反应体系的荧光定量 PCR。
6. 本产品只适用于科研，不能用于临床诊断。
储存条件：-20℃以下，有效期12个月。

实验过程：
一、试剂准备
1. DNA模板
2．对应目的基因的特异引物（在PCR反应中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能继续按照模板DNA复制，而不能从无到有，凭空合成。这一小段序列就是你所要有设计的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根据你的模板链设计。因此，扩增不同的基因需要设计不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步骤
1．在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。
2．调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。一般：在93℃预变性3-5min，进入循环扩增阶段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循环30-35次，zui后在72℃ 保温7min。
3．结束反应，PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。
4．PCR的电泳检测：如在反应管中加有石蜡油，需用100μlLuFang进行抽提反应混合液，以除去石蜡油；否则，直接取5-10μl电泳检测。
三、注意事项
１．PCR反应应该在一个没有DNA污染的干净环境中进行。设立一个的PCR实验室。
２．纯化模板所选用的方法对污染的风险有极大影响。一般而言，只要能够得到可靠的结果，纯化的方法越简单越好。
３．所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染。操作过程中均应戴手套。
４．PCR试剂配制应使用zui高质量的新鲜双蒸水，采用0.22μm滤膜过滤除菌或高压灭菌。
５．试剂都应该以大体积配制，试验一下是否满意，然后分装成仅够一次使用的量储存，从而确保实验与实验之间的连续性。
６．试剂或样品准备过程中都要使用一次性灭菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿应洗涤干净并高压灭菌。
７．PCR的样品应在冰浴上化开，并且要充分混匀。

使用方法：
一、样品采集：
1、食品样品：样品的采集与预培养按照样品的采集与预培养按照菌检验要求进行。
2、血液样品：用无菌注射器抽取受检者静脉血2mL，注入无菌EDTA2Na(或柠檬酸钠)抗凝管，立即混匀。
3、粪便样品：取粪便置于灭菌的收集管中送检。
4、病灶部位样品：取发病部位新鲜渗出物、粘液脓血送检。
一、稀释 PCR 阳性对照（以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）
1. 注意：由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供可以直接使用的 DNA 片段作为阳性对照。
2. 标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。
3. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 模板稀释液（用带芯枪头，下同）。
4. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照，充分震荡 1 分钟，得1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
5. 换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用
6. 换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照到 5 号管中，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
7. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的阳性对照。放冰上待用。
原理:
所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
检测方法
1.SYBRGreenⅠ法：
在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加*同步。
SYBR定量PCR扩增荧光曲线图
PCR产物熔解曲线图
2.TaqMan探针法：
探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成*同步。

3--2-氯吡分子式：128.56英文名称：3- amino -2-：6298-19-7分子量： C5H5ClN2

2-甲喹啉分子式：143.19英文名称：2- methyl group：91-63-4分子量： C10H9N

3--5-(4-溴)异噁唑分子式：239.07英文名称：3- - -5- (4- Bromophenyl) isoxazole：6525-98-0分子量： C9H7BrN2O

反-十氢萘分子式：138.25英文名称：Trans ten hydrogenation of naphthalene：493-02-7分子量： C10H18

铝酞菁英文名称：Aluminum phthalocyanine分子式：574.97分子量： C32H16AlClN8：14154-42-8

药碱英文名称：Hydrochloric acid分子式：373.8301分子量：C20H20ClNO4：6681-15-8

性红33英文名称：Acid red 33分子式：467.38分子量： C16H11N3Na2O7S2：3567-66-6

4-甲氧-3,5-二甲-2-吡甲分子式：167.21英文名称：4- methyl -3,5- two methyl -2- pyridine methanol：86604-78-6分子量： C9H13NO2

1-[(2-乙己)氧]-4-甲氧分子式：236.35英文名称：1-[(2- ethylhexyl) oxygen]-4- dimethoxybenzene：146370-51-6分子量： CH3OC6H4OCH2CH(C2H5)(CH2)3CH3

紫杉英文名称：Taxol分子式：853.91分子量：C47H51NO14：33069-62-4

1-Boc-3-甲分子式：214.3英文名称：1-Boc-3- methyl piperidine：392331-89-4分子量： C11H22N2O2

芝麻源性成分探针法荧光定量PCR试剂盒人整合 SV40基因的腺上皮细胞英文名称：

沙门氏菌显色培养基配套平皿/Salmonella Chromogenic Medium Dish9㎝/块国产/进口

肌肌酸激酶(CKM)天然蛋白 英文名称：Native Creatine Kinase, Muscle (CKM) 

酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiae烟曲霉 Aspergillus fumigatus

MRC-5(人胚肺成纤维细胞 )葡萄牙假丝酵母 Candida lusitaniae

小鼠淋巴管内细胞*培养基100mL

TE-1(人食管细胞)5×106cells/瓶×2

T-47D(人腺管细胞)GC-1, 鼠原细胞

小鼠内脏脂肪细胞*培养基100mL

戊糖杆菌 Lactobacillus pentosusNEC(人食管细胞)

TG-905(人脑胶质母细胞瘤细胞)5×106cells/瓶×2