人高迁移率族蛋白B1（HMGB-1）ELISA检测试剂盒实验原理 
本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人高迁移率族蛋白 B1（HMGB-1）水平。用纯化的人迁移率族蛋白 B1（HMGB-1）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加高迁移率族蛋白 B1（HMGB-1），再与 HRP 标记的高迁移率族蛋白 B1（HMGB-1）抗体结合形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过*洗涤后加底物 TMB 显色。TMB 在HRP 酶的催化转化成蓝色，并在酸的作用下转化成zui终的黄色。颜色的深浅和样品中的高迁移率族蛋白B（HMGB-1）呈正相关。用酶标仪在 450nm波长下测定吸光度（OD 值），通过标准曲线计算品中人高迁移率族蛋白B1（HMGB-1）浓度。 

试剂盒组成 

1 30 倍浓缩洗涤液 20ml×1 瓶 7 终止液 6ml×1瓶 

2 酶标试剂 6ml×1 瓶 8 标准品（320µg/L） 0.5ml×1 瓶 

3 酶标包被板 12孔×8 条 9 标准品稀释液 1.5ml×1 瓶 
4 样品稀释液 6ml×1 瓶 10 说明书 1份 
5 显色剂A 液 6ml×1 瓶 11 封板膜 2张 
6 显色剂B液 6ml×1/瓶 12 密封袋 1个 
标本要求 
1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融 

2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。 

人高迁移率族蛋白B1（HMGB-1）ELISA检测剂盒操作步骤 
1. 标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。 

160µg/L 5号标准品 150µl的原倍标准品加入150µl标准品稀释液 
80µg/L 4号标准品 150µl的5号标准品加入150µl标准品稀释液 
40µg/L 3号标准品 150µl的4号标准品加入150µl标准品稀释液 
20µg/L 2号标准品 150µl的3号标准品加入150µl标准品稀释液 
10µg/L 1号标准品 150µl的2号标准品加入150µl标准品稀释液 
2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50µl，待测样品孔中先加样品稀释液40µl，然后再加待测样品10µl（样品zui终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。 

3. 温育：用封板膜封板后置37℃温育30 分钟。 
4. 配液：将30 倍浓缩洗涤液用蒸馏水30 倍稀释后备用 
5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置 30 秒后弃去，如此重复5次，拍干。 

6. 加酶：每孔加入酶标试剂50µl，空白孔除外。 
7. 温育：操作同3。 
8. 洗涤：操作同5。 
9. 显色：每孔先加入显色剂A50µl，再加入显色剂B50µl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分

钟. 
10. 终止：每孔加终止液50µl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。 
11. 测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD 值）。 测定应在加终止液后15分钟以内进行。 

计算 
以标准物的浓度为横坐标，OD 值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD 值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD 值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。 

人高迁移率族蛋白B1（HMGB-1）ELISA检测试剂盒注意事项 
1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡 15-30 分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。 

2．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。 
3．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。 

4． 请每次测定的同时做标准曲线，做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本OD 值大于标准品孔*孔的OD 值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计算时请zui后乘以总稀释倍数（×n×5）。 

5． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。 
6．底物请避光保存。 
7．严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准. 
8．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。 
9．本试剂不同批号组分不得混用。 
人高迁移率族蛋白B1（HMGB-1）ELISA检测试剂盒保存条件及有效期 
1．试剂盒保存：；2-8℃。 
2．有效期：6个月